高效液相色谱法检测鼠饲料中抗菌肽NZ2114

【目的】本研究旨在建立鼠粉状饲料中抗菌肽NZ2114固相萃取-高效液相色谱(SPE-HPLC)快速分析方法,用于检测低、中、高浓度(2、10和50 g/kg)的鼠粉状饲料中受试物NZ2114含量,以分析抗菌肽NZ2114是否均匀分布。【方法】试验分别对提取条件、净化柱和净化方法进行优化,并考察了提取剂、提取时间对提取效率的影响,SPE清洗剂、洗脱剂等对回收率的影响。饲料样品经超声提取后离心,上清液经WCX固相萃取柱富集,随后用3 mL甲醇和5 mL 20%氨化甲醇进行净化洗脱。HPLC检测方法以ZORBAX Eclipse Plus C18作为固定相,0.1%甲酸-乙腈和0.1%甲酸-水作为流动相,柱温35℃,进样量20μL,以1.0 mL/min流速,按照梯度洗脱的方式洗脱,在波长276 nm下采用外标法定量检测饲料样品中NZ2114含量,并对该方法的线性、检测限与定量限、基质效应、回收率、日内与日间精密度进行考察。【结果】SPE-HPLC分析方法在62.5～4 000μg/mL浓度范围内线性关系良好,线性方程为y=0.9353x-32.721,相关系数(R²)...     

植物乳杆菌和戊糖片球菌活菌计数检测

对本研究室所研制的一种微生物青贮剂所含植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum,LP)、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus,PP)建立了活菌数量的检测方法。PP比LP繁殖能力和活力都强。     

秸秆覆盖还田及腐解率对土壤温湿度与玉米产量的影响

为探究东北黑土区秸秆覆盖还田及其腐解率对土壤温湿度和玉米产量的影响,2019年和2020年在大庆市肇州县进行了秸秆覆盖全量还田（试验组）和留茬10cm左右还田处理（对照组）对比试验。结果表明：试验组秸秆腐解率4月仅为4.3%和4.5%,5月为17.8%和16.8%,6月为22.3%和27.8%,秸秆腐解主要集中在7、8月。土壤温湿度受地表残余秸秆影响较为明显,5月试验组土壤含水率比对照组分别低1.2、1.1个百分点,但随着秸秆腐解率增大,试验组土壤含水率在6—9月平均高出对照组约3个百分点。试验组0cm处土壤温度在5—8月日间大气升温阶段受到抑制,相同时段温度与对照组最大差值为4.8、3.8℃,10、20cm处土壤温度在5、6月受地表秸秆覆盖影响较为明显,7—9月影响不显著,30cm处土壤温度除6月影响明显外,其他月份相比对照组变化较小。在每天大气降温时段,试验组不同深度处的土壤温度降温较对照组平缓,保温保墒作用较明显。地表秸秆覆盖影响作物出苗,试验组比对照组出苗分别晚4、3d,在拔节期对照组比试验组的作物株高分别高7.3、7.4cm,茎粗大0.2、0.1cm,但在抽穗期和灌浆期试验组的株高和茎粗均大于对照组;2019年试验组的玉米产量为10716.0kg/hm2,比对照组增产193.5kg/hm2。综合分析,秸秆覆盖还田对土壤温湿度具有双向阻碍作用,秸秆腐解程度对双向阻碍作用有一定影响,秸秆覆盖全量还田的保温保墒作用促进了玉米的生长和产量提升。     

噬菌体裂解酶Lysep3的毕赤酵母重组表达和活性分析

试验以突破噬菌体裂解酶Lysep3应用瓶颈为切入点,采用酵母表达系统对其进行重组表达以期降低生产成本,同时初步探究其体外抗菌活性和安全性,以期为临床试验提供数据参考。根据毕赤酵母密码子偏爱性优化并合成Lysep3基因,将其连接至表达载体pPICZαA。经菌落PCR和测序验证后,将线性化重组载体pPICZαA-Lysep3电转化巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris X-33。重组酵母转化子经菌落PCR和摇瓶水平甲醇诱导重组蛋白初筛后,在5 L发酵罐中高密度发酵,发酵上清液经His-trap HPGE纯化柱纯化。通过抑菌试验和浊度试验进行rLysep3的抑菌活性分析,通过测定rLysep3对巨噬细胞RAW264.7细胞毒性和小鼠血红细胞溶血性进行rLysep3的安全性分析。结果显示,重组菌在5 L发酵罐中甲醇诱导120 h后Lysep3的表达量达749.2 mg/L。抑菌活性分析发现,rLysep3对肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、猪葡萄球菌及无乳链球菌均具有抑菌活性,且rLysep3可与EDTA联合作用使肠炎沙门氏菌菌落数下降1.6~1.7个数量级。此外,细胞毒性试验发现,rLysep3在1 024 μg/mL浓度下细胞存活率仍可达78.75%;溶血性分析显示,1 024 μg/mL浓度下溶血率仅为1.58%。上述结果证明,通过毕赤酵母表达系统实现了Lysep3的重组表达,rLysep3具有体外抑菌活性,且具低细胞毒性和低溶血性。从抗菌活性、产业化制备及安全性等方面初步显示出rLysep3具有开发为临床治疗禽肠炎沙门氏菌感染的新型抗菌药物的潜力。     

饲料产品中转基因成分定量分析的问题与对策

文章综述了国内外农产品转基因成分标识管理的现状,评价了现有转基因作物定量检测方法的特点与弊端,提出了以基因特异性为依据、建立更适合饲料等复杂产品中转基因成分定量检测的改进建议。     

抗菌肽NZ2114对奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌细胞膜、基因组和耐药性的影响

本试验以真菌防御素Plectasin衍生肽NZ2114和奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌为研究对象,旨在阐明抗菌肽NZ2114对金黄色葡萄球菌的体外抗菌机制及其阻遏金黄色葡萄球菌耐药性的效果。通过16S rRNA基因鉴定对55份乳房炎奶样中的病原菌进行分离鉴定,采用纸片扩散法检测其耐药性,通过微量稀释法测定抗菌肽NZ2114对金黄色葡萄球菌的抑菌活性,借助流式细胞术和扫描电镜观察抗菌肽NZ2114对金黄色葡萄球菌细胞膜完整性及细胞形态的影响,通过凝胶阻滞和圆二色谱分析抗菌肽NZ2114对金黄色葡萄球菌基因组DNA的影响,将抗菌肽NZ2114与金黄色葡萄球菌共同孵育以研究抗菌肽NZ2114对金黄色葡萄球菌耐药性的影响,通过PCR进一步分析抗菌肽NZ2114对金黄色葡萄球菌携带的耐药基因的影响。结果表明,共获得10株金黄色葡萄球菌,分离菌对青霉素等9种抗菌药具有耐药性,且50%为多重耐药。抗菌肽NZ2114对10株金黄色葡萄球菌具有强抑菌活性,最小抑菌浓度(MIC)为0.5～1.0μg/mL。抗菌肽NZ2114可导致金黄色葡萄球菌S7细胞皱缩、细胞内容物泄漏,甚至细胞裂解,碘化丙啶(PI)细胞膜穿透率达5%,且抗菌肽NZ2114可与金黄色葡萄球菌S7基因组DNA结合并改变其DNA结构。金黄色葡萄球菌与1/4×MIC抗菌肽NZ2114孵育12 h后发现,除对阿莫西林和磺胺异噁唑的耐药率没有降低外,对其他抗菌药的耐药率均有不同程度的降低(10%～40%),且抗菌肽NZ2114对β-内酰胺类耐药基因(blaZ)及杆菌肽类耐药基因(braRS)的消除率分别达28.57%(2/7)和22.22%(2/9)。上述结果证明,抗菌肽NZ2114对耐药金黄色葡萄球菌具有体外强抑菌活性,其干扰耐药金黄色葡萄球菌细胞膜并结合胞内DNA的作用机制为其低耐药杀菌机制奠定了细胞学基础。同时抗菌肽NZ2114对耐药菌株的耐药性及相关耐药基因均有一定消除作用。由此可见,抗菌肽NZ2114是一种极具前景的治疗金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎的抗生素替代品。     

抗菌肽NZ2114对多重耐药2型猪链球菌感染小鼠的治疗效果评价

为探究抗菌肽NZ2114对猪链球菌感染小鼠模型的体内治疗效果,本试验以NZ2114和2型猪链球菌CVCC 3928为研究对象,利用小鼠模型评价NZ2114治疗猪链球菌感染的效果。36只ICR雌鼠随机均分为6组:空白对照组(不感染,腹腔注射0.2mL PBS)、阴性对照组(感染,腹腔注射0.2mL PBS)、试验Ⅰ和Ⅱ组(感染,分别腹腔注射0.2mL 2.5和5.0mg/kg NZ2114)、阳性对照Ⅰ和Ⅱ组(感染,分别腹腔注射0.2mL 7.5和15.0mg/kg头孢曲松钠)。结果显示,空白对照组和5.0mg/kg NZ2114试验组小鼠存活率均为100%,而15.0mg/kg头孢曲松钠阳性对照组小鼠存活率仅为50%。治疗1d后,5.0mg/kg NZ2114试验组小鼠肺脏和肝脏荷菌量分别下降59.41%(P0.01)和69.19%(P0.01);而15.0mg/kg头孢曲松钠阳性对照组中小鼠肺脏和肝脏荷菌量分别下降43.94%(P0.01)和19.60%(P0.05)。与阴性对照组相比,2.5 mg/kg NZ2114治疗组中抑制炎性因子TNF-α和IL-1β的释放分别下降85.83%(P0.01)和56.20%(P0.05),5.0 mg/kgNZ2114试验组分别降低84.02%(P0.01)和43.86%(P0.05),而15.0mg/kg头孢曲松钠阳性对照组TNF-α及IL-1β的下降率均不显著,分别为24.49%和8.82%。另外,5.0mg/kg NZ2114试验组1d后即可明显减轻小鼠肺组织间质弥漫性炎细胞浸润等炎症症状,抑制肝细胞产生肿胀及空泡性变化,促进脾小结恢复正常;治疗7d后各器官组织临床症状评分基本恢复正常。上述结果表明,NZ2114能有效提高猪链球菌感染小鼠的存活率,显著降低病原菌在小鼠肺脏和肝脏的移位及血清中TNF-α和IL-1β的水平,并有效缓解肝脏、脾脏和肺脏的急性损伤,治疗效果优于头孢曲松钠,具有作为治疗临床猪链球菌病抗生素替代品的潜力。     

稀土尾矿区10种植物对重金属的吸收与富集作用

[目的]为重金属污染土壤的植物修复提供依据。[方法]在冕宁牦牛坪稀土尾矿区采集了10种植物和相应的土壤样品,测定了Ph、Zn、Cu、Cd的含量。[结果]冕宁牦牛坪稀土尾矿区主要是Ph的污染,Pb的浓度为1192．70～5077．19mg／kg。除土荆芥外,其他植物的地上部（TF〉1）对Ph和Zn有富集作用或是地上部与根部富集量相当（苦苣TFPb=0．98）;而Cu和Cd的富集部位均在根部（TF〈1）,但苦蒿（TFCu〉1）除外。豚草对Cu的富集系数大于1,醉鱼草和土荆芥对Cd的富集系数大于1,其他不同种植物对不同类型重金属的富集系数不尽相同,但均小于1。[结论]除土荆芥外,其他9种植物都对Ph和Zn有较强的转移能力。苦蒿对Cu和醉鱼草对Cd有较强的吸收富集能力。     

抗菌肽NZ2114对奶牛乳房炎源停乳链球菌的杀菌作用研究

为探究真菌防御素Plectasin衍生肽NZ2114对奶牛乳房炎源停乳链球菌的体外杀菌效果及其作用机制,本试验采用微量肉汤稀释法检测停乳链球菌CVCC 3938耐药性,通过NZ2114对停乳链球菌CVCC 3938最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）及在胰蛋白胨大豆肉汤（tryptic soy broth,TSB）培养基和全脂灭菌（ultra-high temperature instantaneous sterilization,UHT）牛奶中的杀菌动力学曲线的测定评价其抗菌特性;借助扫描电镜、透射电镜和流式细胞仪观察NZ2114作用下的细菌形态变化;使用凝胶阻滞、荧光光谱和圆二色谱进一步分析NZ2114对细菌基因组DNA的作用。结果显示,停乳链球菌对氧氟沙星和四环素均产生耐药性,临床分离菌株则呈现多重耐药性,NZ2114对受试停乳链球菌和金黄色葡萄球菌的MIC值为0.11~0.45 μmol/L。抗菌肽在TSB培养基和全脂灭菌牛奶中均具有抑菌活性,且在短时间内（0.5~3 h）可使停乳链球菌菌落数下降3个数量级。扫描电镜、透射电镜和流式细胞仪结果表明,抗菌肽NZ2114能够破坏停乳链球菌细胞膜,导致其内容物泄漏。凝胶阻滞、荧光光谱和圆二色谱证实抗菌肽穿过细胞膜后与细菌基因组结合,破坏了DNA,以此达到杀菌目的。上述结果表明,抗菌肽NZ2114对奶牛乳房炎源停乳链球菌杀菌活性强,其破坏菌体细胞膜后可直接作用于胞内的基因组DNA并改变其二级结构。由此可见,抗菌肽NZ2114是一种极具前景的治疗停乳链球菌引起乳腺炎的抗生素替代品。     

新型双向旋球阀工作过程动力学仿真分析

针对具有双向硬密封功能的新型旋球阀的工作过程建立了动力学模型,采用Gear预估-校正算法对新型双向硬密封旋球阀工作过程动力学模型进行了求解和分析.结果表明,由于阀板的偏心结构,新型双向硬密封旋球阀开启时所需要的扭矩比关闭时所需要的扭矩要小;在水流为5 m/s的情况下,新型双向硬密封旋球阀开启时施加在轴上的扭矩不得大于5 500 N·m,关闭时施加在轴上的力不得大于4 650 N·m,否则引起水锤现象.