猪睾丸ACE启动子驱动的SPAG6 shRNA真核表达载体的构建

本文旨在研究猪睾丸ACE启动子驱动的SPAG6 shRNA在猪睾丸支持细胞（ST）中的干扰作用。利用PCR法从ST细胞基因组中扩增猪睾丸ACE启动子,构建重组质粒ACE-pIRES2-DsRed、ACE-pGL3-basic,通过红色荧光蛋白表达和双荧光素酶报告基因检测试验检测猪睾丸ACE启动子在ST细胞中的转录活性;根据SPAG6 mRNA靶序列设计合成3条siRNA序列,通过脂质体转染至ST细胞,利用实时荧光定量PCR及Western Blot检测siRNA的干扰效率;基于人miR-30a结构设计SPAG6 shRNA,构建重组载体ACE-sh-SPAG6-pcDNA3.1,Western Blot检测其对SPAG6的干扰效果。结果表明,成功构建重组质粒ACEpIRES2-DsRed、ACE-pGL3-basic,并证明猪睾丸ACE启动子在ST细胞中具有较强的转录活性;各试验组均能对靶基因SPAG6 mRNA的表达产生抑制作用,以siRNA-3的作用最佳。siRNA-3转染48 h后,SPAG6蛋白表达量显著下降（P<0.001）,成功筛选出SPAG6基因的最佳干扰序列;成功...     

湖北白猪精原干细胞分离培养及初步鉴定

以5日龄、10日龄和15日龄湖北白猪睾丸为主要研究对象,采用浓度为4 mg/mLⅣ型胶原蛋白酶联合0.25%胰蛋白酶两步酶法消化法获取湖北白猪精原干细胞,通过低速离心和差异贴壁法对湖北白猪精原干细胞进行纯化,以湖北白猪睾丸支持细胞作为饲养层进行体外培养,结合碱性磷酸酶(AKP)进行染色鉴定。结果表明,培养获得的细胞即为目的细胞SSCs。     

小分子化合物靶向DNA连接酶Ⅳ提高CRISPR/Cas9基因编辑效率的研究进展

基因编辑工具能够在DNA链上制造特定位点双链断裂(Double-strand breaks,DSB)。细胞内具有修复DSB的2种不同途径,即同源重组(HDR)和非同源末端连接(NHEJ)。NHEJ与HDR之间相互竞争,互为替代DNA修复途径。DNA连接酶IV参与NHEJ途径并发挥重要作用。DNA连接酶IV抑制剂可以抑制DNA修复通路中NHEJ的效率,同时可以提高HDR的效率。为了优选小分子化合物实现更有效的基因定点插入,综述了SCR7、NU7026、白藜芦醇、L755507这4种不同的小分子化合物在CRISPR/Cas9基因编辑效率上的研究,归纳了这4种小分子化合物在其中发挥的作用,并用生物信息学软件模拟所用小分子化合物与DNA连接酶IV的对接。在此基础上,对这4种小分子化合物提高基因编辑效率的研究前景进行了展望。     

母猪生殖对策的初探

为了研究哺乳动物生殖对策,以母猪生殖记录为研究对象,对母猪不同胎次间产仔数的变化等进行研究。研究发现,在母猪的不同胎次间存在一定规律。通过优化每次繁殖过程所产生后代的数量,结果将身为发现哺乳动物对外界环境的感知和自适应机制奠定基础。     

培养基的保存温度对牛卵母细胞体外受精的影响

研究了培养基保存温度对牛卵母细胞体外受精的影响。结果表明,基础培养基中激素不同添加时间对牛卵母细胞体外成熟率、牛体外受精胚胎卵裂率及囊胚率差异不显著(P0.05);提前添加激素在4℃不能长期保存,而在-20℃能长期冷冻保存,并不会对牛卵母细胞体外受精胚胎的发育产生太大的影响。     

m6A去甲基化酶FTO对猪肌卫星细胞分化的影响

【目的】探究N⁶-甲基腺苷(m⁶A)去甲基化酶FTO表达水平对猪肌卫星细胞分化的影响,并比较不同表型猪FTO表达和m⁶A甲基化修饰水平。【方法】收集分化第0、2和4天的猪肌卫星细胞,用Western blotting和实时荧光定量PCR分别检测FTO和肌球蛋白重链(MyHC)蛋白表达、肌分化因子(MyoD)和肌细胞生成素(MyoG)的mRNA表达水平;利用免疫荧光法检测肌卫星细胞分化标志基因MyHC表达情况;采用Dot blotting检测m⁶A甲基化修饰水平。将过表达载体(OE-FTO)、空白对照(NC)和FTO基因干扰载体(siRNA-FTO)、阴性对照(siRNA-NC)分别转染猪肌卫星细胞并诱导分化,检测FTO、肌细胞分化相关基因表达情况以及m⁶A甲基化修饰水平,利用免疫荧光法检测MyHC表达以及肌管形成情况;利用Western blotting和Dot blotting分别检测大白猪、宁乡猪不同组织中FTO蛋白表达情况以及m⁶A甲基化修饰水平。【...     

转hFat-1基因猪外源基因整合分析及拷贝数测定

对转人源化Fat-1基因猪的15头传代仔猪进行PCR检测,发现有7头阳性猪,其断奶后成活5头仔猪。对这5头仔猪进行Southern印迹杂交试验,确认3头仔猪整合有hFat-1基因。采用荧光实时定量PCR法测定原代转hFat-1基因公猪及3头阳性仔猪外源基因的拷贝数,分别是2、1、1、2个拷贝。转hFat-1基因猪能够将外源基因遗传到下代仔猪,但外源基因具有遗传不稳定的趋向。     

PLINs基因对脂质的调控及其潜在的育种价值研究进展

周脂素蛋白家族（Perilipins,PLINs）有PLIN1、PLIN2、PLIN3、PLIN4和PLIN5 5种蛋白，该蛋白家族定位于脂滴（Lipid Droplets,LDs）表面，与其他分子相互作用介导脂质的合成与分解。PLIN1可调控脂肪的蓄积，也是脂肪细胞分化的标志物之一。PLIN2是脂质蓄积最重要的调节因子之一，可促进脂质合成，抑制LDs中主要脂质甘油三酯（Triglycerides,TG）和胆固醇酯（Cholesterol Ester,CE）的分解。PLIN3是中性脂质形成的关键基因。PLIN4参与脂肪细胞分化，还可修补脂滴形态的缺陷。PLIN5在LD积累与缓解脂毒性中起关键作用。本文综述了近年关于PLINs家族调控脂质的研究现状及其在畜禽上的应用，旨在阐述其在畜禽生物育种中的潜在育种价值。     

细胞和个体水平沉默效应的差异(英文)

[目的]研究3种不同长度的四联shRNA载体及其在细胞与个体水平的沉默效应差异。[方法]以EGFP为靶标基因,用hU6、mU6、h7SK、hH14种启动子,构建21、27、29bp的3种四联沉默载体,通过转染Vero细胞和注射小鼠肌肉,以实时荧光定量PCR的方法检测绿色荧光蛋白基因的mRNA水平。[结果]3种载体都有很强的沉默效应;其在细胞水平上的沉默效应远高于个体水平上;可以通过未成年鼠的肌肉注射进行转基因。[结论]多位点串联表达shRNA是一种可以达到较好干扰效果的方法;肌肉注射将是一个简便的转基因途径。     

采用真空泵法快速获取猪卵母细胞

试验比较了真空泵法与传统的手动抽吸法对猪卵母细胞成熟效果的影响,结果表明,真空泵法在平均使用时间、卵母细胞的收集效率及A、B级卵母细胞所占的比例方面均优于手动抽吸法,在卵母细胞的成熟率方面稍低于手动抽吸法。表明真空泵法是一种有效的猪卵母细胞采集方法。