甘蓝型油菜叶绿体多顺反子单交换表达载体构建

[目的]为研究质体定位的乙酰辅酶A羧化酶转化叶绿体奠定基础。[方法]根据GeneBank上的甘蓝型油菜的叶绿体DNA序列设计1对引物,通过PCR扩增获得与甘蓝型油菜叶绿体基因组可发生同源重组的DNA片段,构建甘蓝型油菜叶绿体多顺反子单交换表达载体,并在大肠杆菌中通过平板定性分析和Western印迹对所构建载体上的表达盒进行功能鉴定。[结果]以甘蓝型油菜的叶片叶绿体基因组DNA为模板进行PCR扩增,获得4 357 bp的DNA片段,包含2个开放阅读框RbcL和β-CT。成功构建了甘蓝型油菜叶绿体多顺反子单交换表达载体pHBM720,而且同一多顺反子的3个基因均在大肠杆菌中得到表达。[结论]该叶绿体多顺反子单交换表达载体具有较强的通用性与安全性,比双交换表达载体更具优越性。     

油菜RNA干扰(RNAi)文库的构建

为了通过构建高通量RNAi(RNA干扰)双元载体来得到油菜RNAi文库,对PCR引物设计时,在目的片段5′端和3′端分别引入合适的酶切位点序列,在3种中间载体的基础上构建高通量RNAi双元载体pHBMT4。该载体Bsu36Ⅰ酶切位点间的片段可被油菜的任意一种功能片段取代。载体pHBMT4含有用以检测载体功效的gus报告基因,原多克隆位点处被一个插入目标序列表达框取代,该框含有的反向重复nos终止序列可自然形成发夹环结构引发转录后水平的基因沉默(PTGS)。通过抽提的油菜总DNA与载体pHBMT4相连转化获得了油菜RNAi文库,为以后研究油菜的基因组功能打下良好的基础。