夏季保苗期刺参(Apostichopus japonicus)腐皮综合征病原菌的分离鉴定及其致病阈值

2013年夏季山东地区某刺参育苗场处于保苗期的刺参苗种暴发 腐皮综合征疾病,表现为附着力下降、棘刺顶端溃烂、排脏、表皮溃疡和自溶等症状。自患病个体病灶组织分离优势细菌,并利用形态学观察、生理生化测定、回接感染、16S rDNA基因序列分析等方法完成致病原的鉴定。此外,通过对发病前后养殖系统中优势菌丰度的变化,追踪确定了所分离病原菌的致病阈值。结果显示,从患病参苗体表病灶处分离的一株优势菌HP130917A-1,经回接感染证实,该菌株具有较强的致病力,其对刺参苗种的半致死浓度为1.2×106 CFU/ml。生理生化结合分子鉴定表明,该菌株为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)。此外,完成了患病池保苗期间池水和附着基表面微生物菌群结构动态分析,共分离得到了6种主要优势菌,分别为溶藻弧菌、需钠弧菌(Vibrio natriegens)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)和马胃葡萄球菌(Staphylococcus equorum)。溶藻弧菌一直是养殖系统中优势度最高的种类,且随着附着基在保苗池中时间的延长,其在附着基表面沉积物中的浓度越来越高。到第50天时,浓度达到8.97×106 CFU/cm2。而此时系统中参苗开始暴发腐皮综合征疾病,可将此浓度视为该病原的致病阈值。因此,在夏季保苗过程中应加强养殖系统中弧菌总数的监测,制定适宜的附着基更换频率,建立和优化刺参保苗工艺,以期为刺参苗期疾病防控和优化健康养殖管理提供理论依据和参考。     

刺参“参优1号”新品种在不同盐度下的代谢特征和适应性研究

本研究通过测定盐度为14~40条件下,刺参"参优1号"苗种的生长、存活、呼吸代谢及非特异性免疫酶活性差异,确定其适宜和最适盐度条件及其盐度适应机制。结果显示,盐度为23~40时,30 d苗种的存活率(SR)均为100%;盐度在16以下时,苗种全部死亡。盐度为23~40时,苗种的特定生长率(SGR)为正值;盐度为29~37时,SGR较高,为0.9932%/d,盐度为20以下时,SGR降为负值。耗氧率(R_O)和排氨率(R_N)随盐度的变化呈现出以32为波谷"M"型变化,盐度为32条件下的R_O和R_N分别为0.0130和0.00138 mg/(g·h)。不同盐度组刺参的O:N值均为8左右,O:N值随盐度升高无显著差异。盐度的升高和降低会引起刺参体腔液中酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、溶菌酶(LZM)、超氧化物歧化酶(SOD)活性显著升高(P<0.05),在苗种适应盐度胁迫过程中,各盐度组SOD活性的峰值一般在0 d出现,而ACP、AKP活性在第10天出现峰值,LZM活性的峰值在10~20 d。研究表明,刺参"参优1号"适宜的生长盐度为23~40,最适盐度范围为29~37,盐度变化会导致苗种呼吸代谢和免疫酶活性的变化,研究结果将为刺参"参优1号"苗种的推广提供科学依据。     

基于toxR基因的轮虫弧菌荧光定量微流控快速检测技术的建立

以轮虫弧菌的单拷贝基因toxR基因的高保守区域为目的片段,设计特异性引物,构建重组质粒标准品,建立针对该菌的荧光定量PCR检测方法。以此为基础,实验选用UF-150 Genechecker微流控荧光定量PCR仪,通过优化反应体系和反应条件,建立了轮虫弧菌的微流控荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法能特异性扩增toxR基因目的片段,对轮虫弧菌纯培养物检测下限为1.34×10⁰ 拷贝/μL。在人工感染样品中的应用结果显示,对鱼体组织中轮虫弧菌的检测下限为1.34×10³ CFU/g,检测结果可以目视判读,检测时间缩短至42 min以内。研究表明,该检测方法具有特异性强、敏感度高、场地要求低等突出优势,适于开发水产病原实用性的现场快速检测技术。     

山东主要刺参养殖区幼参肠道抗生素耐药菌及耐药基因分布特征

为解析目前刺参(Apostichopus japonicus)苗种携带耐药菌及耐药基因现状,本研究从烟台、威海、青岛3个刺参主要养殖区的6家养殖场采集了幼参,对其肠道内容物中常用抗生素的耐药菌数量、占比和种类进行检测。利用荧光定量PCR技术,对样本中4类抗生素的7种耐药基因分布情况进行分析。结果显示,所检测的6个采样点中均有6种抗生素耐药菌的检出,从耐药菌占比来看,耐药菌占比最高的种类是乙酰甲喹、萘啶酸和四环素耐药菌,占比分别为0.05%~40.06%、2.16%~39.94%和0.06%~23.15%,氟苯尼考、庆大霉素和链霉素耐药菌的占比均不高,占比范围为0.01%~4.15%。由所分离到的98株耐药菌的鉴定结果可以看出,可培养的抗生素耐药菌分为4门5纲30属,主要集中在弧菌属、芽孢杆菌属和嗜冷杆菌属,占检出率的15.30%、13.27%和12.25%。基于属水平的不同抗生素耐药菌种类的分布统计结果显示,各采样点耐药菌种类差异较大,而且弧菌属、芽孢杆菌属和嗜冷杆菌属中均存在同一菌属中有耐多种抗生素的情况。对6个样本7种抗生素耐药基因的丰度检测结果显示,同一类抗生素的不同耐药基因的含量差异显著,除氨基糖苷类抗生素耐药基因aadA的相对拷贝数比例和链霉素以及庆大霉素耐药菌占比之间存在显著相关性(P<0.05)外,其他抗生素耐药基因的丰度与耐药菌占比之间相关性不显著(P>0.05)。研究表明,苗期刺参中存在一定的携带耐药菌和耐药基因的风险。     

金乌贼幼体弧菌性坏死病的病原、组织病理特征和药物敏感性

对青岛市黄岛区人工繁育金乌贼(Sepia esculenta)苗种大规模坏死病进行了病原、组织病理、传播途径和防控药物研究。发病金乌贼幼体不摄食,生长缓慢,体色发黑;体表、肌肉、口腕、触腕及内脏团大面积溃烂,死亡率高达90%;组织病理学显示:患病金乌贼皮肤色素细胞崩解,肌丝断裂,鳃丝崩解,肝细胞大量坏死脱落,肠道微绒毛脱落;从患病金乌贼分离出3株优势菌(SE-A、SE-B和SE-C),人工感染实验表明,SE-B、SE-C对金乌贼半数致死量分别为3.98×10~6 CFU/mL和8.91×10~5 CFU/mL,有较强致病力,为该病的致病菌;根据细菌形态、生理生化和16S rDNA序列分析将SE-B和SE-C鉴定为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和塔氏弧菌(Vibrio tubiashii)。分析金乌贼幼体、育苗用水和生物饵料糠虾的病原菌来源、分布和优势度,发现致病菌主要由糠虾携带进入育苗系统。分析了2株致病菌的药物敏感性,SE-B对强力霉素和氟苯尼考等敏感,对链霉素、庆大霉素等耐药;SE-C对氟苯尼考和罗美沙星等敏感,对新霉素和克拉霉素等耐药。     

基于SSR标记的刺参不同地理群体的遗传结构分析及指纹图谱构建

为分析中、韩、俄沿海刺参(Apostichopus japonicus)种质遗传结构,本研究采用SSR指纹图谱技术对中国青岛、烟台,韩国浦项、群山、木浦,俄罗斯符拉迪沃斯托克的不同刺参群体进行遗传多样性分析和指纹图谱构建。结果显示,13个微卫星座位的平均观测杂合度(Ho)和平均期望杂合度(He)分别为0.47和0.80。13个位点的多态信息含量(PIC)为0.465(AJ06)~0.909(AJ09),除AJ06为中度多态性(0.250.50)。单个位点的等位基因数(A)为10(AJ06)~34(AJ07),平均等位基因数为19.4个。各位点的有效等位基因共83.8个,各位点的有效等位基因数(Ne)为1.7(AJ06)~11.8(AJ09),平均有效等位基因数为6.5。各群体遗传多样性分析结果显示,8个群体的PIC指数为0.6392(韩国木浦)~0.7122(中国青岛),说明相应群体均具有较高的遗传多样性。构建的DNA指纹图谱可将所采集的8个群体区分开。遗传结构分析结果显示,8个刺参群体分配到3个自由交配群中,与UPGMA聚类分析结果相一致。UPGMA聚类分析结果显示,中国青岛、烟台群体与韩国木浦黑参群体聚为一支,俄罗斯刺参群体、韩国浦项黄参群体、韩国群山黑参群体和韩国浦项黑参群体聚为一支,而韩国浦项红参群体作为外群,单独聚为一支。刺参分群及聚类分析表明,不同群体的遗传结构及遗传分化情况不仅与地理位置相关,还与刺参体色有一定的相关性。本研究结果可为刺参种质资源保护及不同地理种群刺参的鉴别提供技术支撑。     

两种疾病发生对养殖半滑舌鳎肠道菌群结构的影响分析

为研究疾病发生情况下鱼类肠道菌群的结构变化,运用高通量测序方法分别对感染腹水病和皮肤溃疡病的工厂化养殖半滑舌鳎病鱼及同一养殖系统中健康鱼的肠道菌群结构进行了对比分析。结果发现,养殖半滑舌鳎肠道中的细菌种类要明显少于环境中的细菌种类,仅为养殖池进水和颗粒饲料中细菌种类总数的14.3%~44.7%。在疾病发生后,病鱼肠道中的细菌种类数量仅是同一养殖系统中健康鱼肠道细菌种类数量的45.8%和64.5%,病鱼肠道中细菌多样性下降非常明显。进一步分析肠道菌群结构的组成发现,虽然发病鱼和健康鱼肠道中超过60%的细菌种类不相同,但优势菌群的结构组成差异不明显,丰度最高的前10种细菌种类基本相同,其比例超过肠道相对总菌量的80%。不同疾病的发生对半滑舌鳎肠道菌群结构的影响也不同,腹水病会造成肠道中优势菌株的种类和相对丰度都发生比较明显的改变,而皮肤溃疡病发生前后肠道菌群结构组成几乎没有变化。研究表明,养殖半滑舌鳎的肠道菌群结构相对比较保守,而且并不是所有的疾病种类都会引起肠道菌群结构发生改变。     

饥饿胁迫对刺参(Apostichopus japonicus)免疫和生长的影响

为了探究饥饿胁迫对刺参免疫和生长的影响,在11?13℃条件下,研究体质量为(20±0.15)g的刺参在不同时间(0、10、20、30、40、50、60 d),饥饿胁迫对体腔液中酸性磷酸酶(ACP)活性、溶菌酶(LZM)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、呼吸爆发(RB)活性、吞噬活性以及对刺参体质量、脏壁比、存活率的影响。研究结果表明,随着饥饿时间的延长,刺参体腔液中的ACP活性、LZM活性呈现降低的趋势,饥饿60 d后,比初始值分别下降47.06%、17.57%;SOD活性、RB活性和吞噬活性呈现出先上升后下降的趋势,分别在饥饿胁迫第20、20、10天时达到最高值依次为32.88、0.328、1.35 U/ml,其后显著下降,第60天时显著低于初始值,分别下降27.87%、38.08%、53.43%;其体质量在第60天时为初始体质量的68.08%,呈现负生长;脏壁比逐渐增大,第60天时为0.56,显著高于初始值0.44(P0.05)。随着存储营养物质的消耗,刺参体质量损失率增加,存活率下降,存活率与体质量损失率之间存在着y=?0.0354x2+0.4354x+99.117的函数关系,呈二次曲线线性负相关。研究结果显示,饥饿时刺参通过消耗体内的营养物质来满足机体需要,长期的饥饿有可能降低刺参的免疫能力,直接影响刺参的健康和生长。     

刺参养殖池塘中新敌害生物澳洲异尾涡虫的鉴定及其危害

为了对导致辽宁大连、山东东营的2家养殖场池塘养殖刺参大量化皮死亡的新的敌害生物进行鉴定并确定其对养殖刺参的危害。本实验通过形态学观察、分子鉴定及系统发育分析确定了涡虫的分类地位,通过生态学方法确定了其生态适应条件,通过切割后培养的方法观测了其再生能力,通过与刺参苗种的共培养实验测试了该物种对刺参的危害及其危害方式。形态学观察结果显示,该涡虫体长0.96～3.26 mm,体宽0.49～1.93 mm,外观黄色或黄褐色,头部钝圆,具一对暗红色棒状眼点,尾部具两条并列的尾垂;显微镜镜检发现其表皮下分布密集的虫黄藻,体表周生纤毛,雌雄同体,口后具有两个生殖孔;对该物种COⅠ及18S r DNA基因片段扩增测序结果进行分析,并构建基于18S rDNA基因的系统发育树,结果显示该生物与澳洲异尾涡虫序列同源性达99.64%,根据其形态学特征,并结合18S rDNA分子鉴定结果,将该生物鉴定为澳洲异尾涡虫;进一步对其生活习性进行了研究,结果显示,该生物具有避光性,其适宜温度为18～24°C,适宜pH为5.5～8.0,适宜盐度为20～40;再生实验表明,该物种具有很强的前后轴极性再生能力;该生物与刺参的共培养实验表明,澳洲异尾涡虫对刺参体表表现出很强的趋向性,可以吸附在刺参体表导致刺参苗种溃疡、化皮甚至死亡,但刺参的体腔、肠道、呼吸树内均未发现虫体寄生。研究表明,澳洲异尾涡虫是营自由生活的池塘养殖刺参的一种新的敌害生物,在养殖过程中需要密切关注并防范该敌害生物。     

浒苔营养成分分析与投喂刺参试验

进行了浒苔(Enteromorpha prolifera)的营养成分测定及投喂刺参(Apostichopus japonicus)的生长试验观察。营养成分检测结果显示,浒苔是一种高蛋白、低脂肪、矿物元素含量丰富的安全藻类食品。另外,分别以浒苔、海泥、浒苔∶海泥(质量比3∶7)、配合饵料∶海泥(质量比3∶7)4种饲料投喂刺参30 d。试验结果:浒苔∶海泥(3∶7)组既有最好的增重率,也有良好的成活率和健康状况;配合饵料∶海泥(3∶7)组次之;而单独投喂浒苔组或海泥组则表现较差。研究结果表明,浒苔具有良好的营养作用,可替代马尾藻、鼠尾藻、海带等作为一种优质的刺参养殖用饵料源。