罗非鱼和斑点叉尾鮰血清IgM的纯化及兔抗血清的制备

为深入了解罗非鱼和斑点叉尾鮰免疫机理及建立相关免疫检测方法,采用rProtein A Sepharose亲和层析一步法纯化罗非鱼和斑点叉尾鮰血清免疫球蛋白（IgM）,并制备其兔抗血清.结果表明,rProtein A Sepharose亲和层析法可以较好地分离获得高纯度的罗非鱼和斑点叉尾鮰血清IgM,通过SDS-PAGE电泳检测,发现罗非鱼血清IgM重链和轻链分子量分别为88.0、21.0 kDa,斑点叉尾鮰血清IgM重链分子量为101.0 kDa.以纯化的罗非鱼和斑点叉尾鮰血清IgM为抗原,制备其兔抗血清,间接ELISA检测其效价分别为1∶32000和1∶16000;Western blotting检测分析,发现罗非鱼和斑点叉尾鮰的兔抗血清分别在88.0和101.0 kDa附近各出现1条反应条带,说明其兔抗血清具有免疫活性.     

罗非鱼致病性海豚链球菌药敏及中草药提取液体外抑菌试验

采用琼脂扩散法和二倍稀释法测定了28种抗生素和10味中草药对一株罗非鱼致病性海豚链球菌(Streptococcus iniae)的抑菌作用。结果表明:28种抗菌类药物中,病原菌对头孢克洛、克拉霉素、头孢噻吩、先锋必、菌必治、头孢拉定、新生霉素、先锋Ⅴ、罗红霉素、头孢呋肟、头孢氨苄11种药物敏感,对卡那霉素、氨曲南、头孢克肟、林可霉素4种药物表现耐药性。10种中草药水提取物对海豚链球菌均有不同程度的抑菌作用,其中黄连水提物的抑菌作用最佳,其对海豚链球菌的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)分别为3.75mg/mL和7.50mg/mL,抑菌圈平均直径达20mm以上;金银花、黄芩、大黄、连翘、黄柏有一定的抑菌作用,MIC为7.50~15.0mg/mL,抑菌圈平均直径均在10mm以上;而大青叶、穿心莲、蒲公英、龙胆草的抑菌作用不明显或无抑菌效果。     

斑点叉尾肠败血症(ESC)PCR诊断方法的建立

由爱德华氏细菌引起的肠败血症(ESC,又称爱德华氏病)是影响斑点叉尾养殖最大的疾病。为快速和准确的诊断该疾病,本研究以NCBI公布的爱德华氏细菌eip基因(GeneBank登录号为AF037441)为模板序列,设计种特异性诊断引物,成功建立了用于斑点叉尾肠败血症病原菌的PCR检测方法。研究结果表明,该方法能够直接从发病斑点叉尾脑、肝、脾和肾组织中检测到爱德华氏菌,检测的最低量为21个细菌;同时,该诊断方法与I型荧光假单胞菌、点状产气单胞菌点状亚种、鳗弧菌、温和气单胞菌、肠型点状产气单胞菌、柱状黄杆菌、嗜水气单胞菌、河弧菌、豚鼠气单胞菌及海豚链球菌等常见水产病原菌无交叉反应。临床样品检测证明,本研究所建立的PCR检测方法可以用于斑点叉尾肠败血症的快速诊断。     

几种水产常用抗生素对无乳链球菌的抑菌活性

为了筛选无乳链球菌敏感药物,对9种常用渔药抗生素进行了药物敏感试验,采用微量肉汤稀释法进行测定,通过加入阿尔玛蓝指示剂和革兰氏染色显微镜观察,得出各抗菌药物的最低抑菌浓度依次为:恩诺沙星0.3μg/mL,氟苯尼考0.3μg/mL,阿莫西林5.2μg/mL,诺氟沙星0.9μg/mL,强力霉素0.9μg/mL,庆大霉素13.0μg/mL,林可霉素17.6μg/mL,新霉素22.0μg/mL,磺胺嘧啶133.3μg/mL。结果表明,恩诺沙星和氟苯尼考对无乳链球菌最敏感,杀菌力最强;在试验过程中,阿尔玛蓝指示剂有助于抑菌结果的判断。     

广西罗非鱼链球菌病流行菌株PCR鉴定和PFGE基因型分析

为获知近年广西罗非鱼链球菌病流行菌种及其基因型变化信息,采用特异PCR方法对2006~2012年从广西发病罗非鱼分离获得的77株临床菌株进行鉴定,并通过脉冲电场凝胶电泳(PFGE)对2006~2011年分离获得的37株流行菌株进行基因型分析。结果显示,其中20株鉴定为海豚链球菌(Streptococcus iniae,S.iniae)其余57株鉴定为无乳链球菌(Streptococcus agalactiae,S.agalactiae)。2006~2007年获得的19株流行菌株中有18株为海豚链球菌(94.7%),仅1株无乳链球菌;2009~2012年分离的58株流行菌株中56株为无乳链球菌(96.6%),仅2株海豚链球菌。PFGE图谱聚类显示,海豚和无乳链球菌分别聚类为两个大分支,20株海豚链球菌共产生4种PFGE带型,带型相似度在83.9%~100%之间;17株无乳链球菌共产生5种PFGE带型,带型相似度在47.4%~100%之间。研究表明,广西罗非鱼链球菌病流行菌种已从过去(2008年前)以海豚链球菌为主转变为现在(2009~2012年)以无乳链球菌为主;流行菌株PFGE基因型存在多样性。     

无乳链球菌感染方式对罗非鱼血常规和抗体消长规律的影响

【目的】明确表皮损伤或某种原因造成的炎症是否是罗非鱼无乳链球菌病暴发的重要诱因，为罗非鱼养殖业疫情预警及无乳链球菌疫苗研制提供参考依据。【方法】将180尾体质量约40 g的吉富罗非鱼随机分为健康组、皮肤创伤组和肠炎组，通过浸泡方式感染无乳链球菌（1.5×106 CFU/mL），分别设3个对应的空白对照组（不感染无乳链球菌）。无乳链球菌感染前及感染后24、48、72、96、120、144和168 h等8个时段，分别每组随机挑选15尾罗非鱼采血，将血液涂片后以吉姆萨染色，观察细胞形态并统计外周血白细胞、中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞数量，同时记录罗非鱼死亡数量。每周以ELISA测定1次罗非鱼血清IgM抗体水平，持续10周。【结果】与健康组罗非鱼相比，皮肤创伤组和肠炎组罗非鱼死亡时间提前，存活率显著降低（P<0.05，下同）。3种感染方式的罗非鱼外周血白细胞、中性粒细胞和淋巴细胞数量在感染初期均呈明显的上升趋势，至感染后168 h皮肤创伤组和肠炎组罗非鱼显著高于健康组罗非鱼（P<0.01，下同），说明无乳链球菌感皮肤创伤或患有肠炎的罗非鱼相对于健康鱼能引起更强烈的免疫反应；皮肤创伤组罗非鱼的外周血单核细胞数量在感染后72~168 h均极显著高于健康组罗非鱼，而肠炎组罗非鱼只在感染后24 h极显著高于健康组罗非鱼。相对于健康组和皮肤创伤组罗非鱼，肠炎组罗非鱼血清抗体水平上升时间更早，持续高水平时间更长；健康组和皮肤创伤组的罗非鱼血清特异性抗体出现时间相近，但皮肤创伤组罗非鱼抗体维持高水平的时间更长。【结论】罗非鱼在无乳链球菌感染前后并发机械性或免疫性病理损伤及炎症，会导致感染死亡率升高，即感染无乳链球菌后会加重因转池、运输、寄生虫感染等造成鱼体表皮受损，或饲料霉变等原因造成的肠炎，进而导致罗非鱼死亡率上升。血常规和抗体水平的消长规律能反映罗非鱼无乳链球菌的感染情况，其中，外周血白细胞数量变化可作为判断罗非鱼感染无乳链球菌后病理损伤和免疫应答的参考指标。