3种有益微生物对菲牛蛭养殖水体理化因子及成活率的影响

为减少高密度养殖下菲牛蛭疾病发生和养殖废水排放,研究比较了3种商品化有益微生物制剂（硝化细菌T1、光合细菌T2和EM复合菌T3）对菲牛蛭高密度养殖水体的净化效果。结果表明,3种有益微生物制剂在15天内均能使养殖水体的pH稳定在6.8以上,溶氧量（DO）分别比对照组提高30.12％（T1）,26.95％（T2）和46.12％（T3）,化学耗氧量（COD）分别比对照组低1.02 mg/L（T1）、1.13 mg/L（T2）和1.53 mg/L（T3）;3个处理组对氨氮（NH4+ - N）的平均降解率分别为：48.48％（T1）,45.23％（T2）和63.10％（T3）,亚硝态氮（NO2- - N）平均值分别比对照组低：0.16 mg/L（T1）,0.19 mg/L（T2）和0.27 mg/L（T3）。3个处理组菲牛蛭存活率均高达90％以上,明显高于对照组（53％）。3种有益微生物制剂均有显著增加溶氧量、降低氨氮、亚硝态氮和化学耗氧量的效应。因此,本研究中3种有益微生物对菲牛蛭养殖水体均具有很好的净化作用,其中以EM复合菌效果最佳。     

罗非鱼海豚链球菌疫苗及其免疫效果的研究

用筛选到的海豚链球菌(Streptococcus iniae)临床分离菌株CMS005,甲醛灭活制备成疫苗并对其进行了注射、浸泡和口服免疫奥尼罗非鱼的效果研究。结果显示:实验室水族箱试验的注射、浸泡和口服免疫的最佳免疫保护率分别为90.5%、61.9%和14.3%,水泥池小网箱试验的最佳免疫保护率分别为100%、86.1%和66.7%。免疫剂量对浸泡免疫效果的影响大于注射和口服免疫,加强免疫可显著提高浸泡和口服免疫效果,超声波处理可以提高浸泡免疫效果。注射和口服免疫7 d和15 d后均可控制罗非鱼海豚链球菌病的继续发生;未免疫组罗非鱼月累计死亡率为4%~16%,而免疫组罗非鱼月累计死亡率低于0.5%;疫苗产生的免疫保护力可持续2~3个月。     

尼罗罗非鱼外周血白细胞总RNA的分离及反转录验证

应用Trizol一步法对尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)外周血白细胞总RNA提取方法进行优化,通过β-ac-tin基因反转录对所分离到的总RNA进行质量验证,并对mRNA的冻干浓缩进行了探讨,确定了一套快速、高效的尼罗罗非鱼外周血白细胞总RNA分离和mRNA浓缩体系。结果显示:获得的总RNA纯度较高,OD260/OD280均在1.9~2.0之间;甲醛变性电泳显示,总RNA完整性良好,28S与18S比值为2∶1;总RNA的分离量与起始白细胞量成正比,每毫升Trizol最大裂解量为1×108个白细胞,可得到总RNA量约为90μg;总RNA的分离量在前四个小时随着沉淀时间的增长而增加,并成功进行了β-actin基因的反转录。mRNA的分离率为1.08%,通过冻干浓缩成功使其浓度提高9倍。结果表明:分离到的总RNA质量可充分满足下游分子生物学实验要求,所建立的mRNA浓缩方法简单易行,可完全解决mRNA起始浓度低的难题。     

奥尼罗非鱼血清免疫球蛋白的纯化及分子量的初步分析

通过饱和硫酸铵盐析结合 Sephadex G-200柱层析的方法,纯化制备了健康非免疫状态下奥尼罗非鱼的免疫球蛋白,进行变性还原条件下的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹试验对血清的免疫球蛋白进行初步分析,发现SDS-PAGE电泳条件下血清重链分子量为85 kD,轻链分子量为30 kD.如果罗非鱼血清免疫球蛋白在自然状态与其他硬骨鱼类一样也为四聚体,那么其总分子量的理论值应为920 kD.     

海豚链球菌LAMP方法的建立及初步应用

为快速准确地检测鱼类海豚链球菌(Streptococcus iniae),减少由其造成的经济损失,建立了一种基于Sim基因高效、敏感的海豚链球菌环介导等温扩增(LAMP)检测技术,并对739个样品进行了检测。结果表明,该方法可以特异性地检测海豚链球菌,而不能检测无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、副乳房链球菌(Streptococcus parauberis)、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)等8种参考菌株。对海豚链球菌DNA最低检测限为5.32拷贝/μL;对739个样品的检测结果显示,8种鱼类海豚链球菌的平均检出率为17.67%,池塘水和海水的检出率分别为13.33%、16.67%;该菌主要发现于罗非鱼脑组织中,其平均检出率为27.04%(43/159),而其他鱼类则主要发现于皮肤,平均检出率为24.14%(42/174);阳性样品主要来自于2014年6月至9月期间,占总检出率的65.00%。     

罗非鱼源Ia和Ib血清型无乳链球菌可溶性蛋白差异分析

前期研究表明,罗非鱼Oreochromis niloticus Ia和Ib血清型无乳链球菌Streptococcus agalactiae疫苗之间缺乏交叉保护力,为了从蛋白分子水平探讨其免疫原性差异的原因,在提取罗非鱼Ia和Ib血清型无乳链球菌可溶性蛋白后应用二维差异凝胶电泳(two dimension-Difference Gel Electrophoresis,2D-DIGE)分析其表达差异蛋白点,应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定这些差异蛋白,并使用DAVID生物学数据库预测经鉴定后获得的蛋白功能。结果表明:在2D-DIGE电泳上,Ia和Ib两种不同血清型无乳链球菌具有167个表达差异蛋白点,对这些蛋白点进行质谱分析获得32种蛋白,这些蛋白主要与氧化还原反应、代谢与能量前体物产生、糖代谢反应等生物学过程有关,主要参与糖解和糖异生作用、丙酮酸代谢与脂肪酸生物合成等通路;对蛋白功能的预测表明,GAPGH、半胱氨酸合成酶和锰依赖性锰超氧化物歧化酶的功能与免疫和疫苗研发相关。本研究首次证实,罗非鱼Ia和Ib血清型无乳链球菌存在较多的表达差异蛋白,部分表达差异蛋白的功能与免疫和疫苗研发相关,这可能与链球菌免疫原性有直接关系,但需要进一步地研究和证实。     

丁鱥鱼胚胎及仔鱼发育的观察

【目的】研究丁鱥鱼在南方较高水温条件下的生长发育情况,解决丁鱥鱼在南方推广养殖中苗种欠缺的瓶颈问题。【方法】对丁鱥亲鱼进行人工繁殖,然后对其胚胎及仔鱼发育过程进行观察记录。【结果】丁鱥鱼催产效应时间11 h,受精率为75.3%,孵化率为82.7%,仔鱼成活率59.3%,育成规格为1.5~2.0 cm鱼苗20.0万尾。丁鱥鱼受精卵呈卵圆形,大部分呈青灰色,直径0.50~0.77 mm,具粘性;在27.0~31.0℃的温度下,受精卵历时1936 min发育后孵出,有效积温为908.89℃·h;胚胎发育可划分为6个阶段30个发育时期。刚孵出仔鱼全长3.84~3.87 mm,出膜后第3 d卵黄囊吸收60%~80%,约有30%仔鱼开口摄食;第4 d卵黄囊吸收90%,约有90%仔鱼开口;出膜第5 d卵黄囊基本吸收完,但出现少许死鱼苗。【结论】丁鱥鱼适宜在南方进行繁殖及鱼苗培育,水温应稳定在20.0~27.0℃,不宜超过30.0℃,在孵化及鱼苗培育过程中注意清除敌害生物及保持清新水质,并根据水温情况及时投喂开口饵料,提高仔鱼成活率。     

罗非鱼海豚链球菌PCR检测方法的建立

为建立准确快速的海豚链球菌鉴定方法,设计合成了海豚链球菌种特异性引物CM1/CM2,进行了其特异基因片段的PCR扩增、反应条件的优化及方法的特异性和敏感性试验;同时还进行了不同检测材料的比较及9份临床样品检测.结果表明,引物CM1/CM2只能从海豚链球菌中扩增到特异性基因片段,供试的其它9种水产常见病原菌PCR扩增均呈阴性;能够检测的最低细菌数在20～30个细菌;方法可直接从病鱼的脑、肝脏、肾脏及脾脏组织检测到该菌;另外,临床菌株检测结果与基于菌株16S rRNA基因序列系统进化分析结果一致.该方法弥补了传统细菌鉴定很难将该菌鉴定到种的缺点,并显著缩短了检测时间及降低了检测成本,具有较好的应用前景.     

斑点叉尾细暴发性海豚链球菌病的研究

于2006-2007连续两年在广西横县、邕江及合浦等网箱养殖的斑点叉尾鲴Ictalurus punctatus中暴发一种流行性传染病,该病波及面广、传染性强,死亡率为30％～100％。鱼的主要发病症状为：浮头、转圈、狂游,发病后期鱼的单边眼睛浑浊、突出,且全身大面积弥漫性出血。作者先后从症状较为典型的斑点叉尾鱼心的脑、肝脏、脾脏和。肾脏组织等部位取样,分离到7株代表性菌株（CMS003～CMS005、CMS009～CMS012）。人工感染试验结果表明,分离菌株对健康斑点叉尾鲴具有很强的致病力,发病症状与自然发病斑点叉尾鲴的症状相同。采用常规形态、生理生化及海豚链球菌Streptococcus iniae特异性PCR诊断和16S rRNA基因序列系统发育进化分析的方法,对分离菌株进行分类鉴定,结果表明,分离的7株细菌均为海豚链球菌。目前,海豚链球菌已成为广西斑点叉尾鲴网箱养殖的高致病性病原菌。     

丁鱥鱼人工繁殖及鱼苗培育技术

【目的】探讨丁鱥鱼人工繁殖及鱼苗培育技术,满足广大水产养殖户对丁鱥鱼苗的需求,为加快丁鱥鱼在广西的推广养殖奠定基础。【方法】2004年11月和2005年3月,两次引进丁鱥1龄鱼进行培育,2005年春挑选成熟鱼进行人工繁育。【结果】亲鱼经过半年强化培育,平均体重600 g/尾以上,雌雄鱼性腺发育到第IV～V期;以促黄体生成素释放激素类似物（LRH-A2）和地欧酮（DOM）混合物催产,经11~13 h的发情效应,均出现产卵行为;经人工孵化和鱼苗培育,第1批的人工孵化率最高,为85.0%,但由于采用池塘孵化,仔鱼遭受池塘敌害生物残食,培育失败;第2、3批的人工孵化率分别为59.3%和63.0%,采用小水泥池孵化,两批共孵化出仔鱼约93.9万尾,培育获得规格为3.0～5.0 cm鱼苗64.8万尾。【结论】通过科学合理的亲鱼强化培育、药物催产、人工孵化及鱼苗培育,可以成功繁育获得丁鱥鱼苗,但繁育过程中要注意水温调控,当水温上升到20℃以上、最好稳定在23～27℃时,应及时安排生产,以利于提高丁鱥鱼苗数量和质量。