倒刺鲃对五种药物的急性毒性试验

对倒刺鲃进行药物敏感性试验．结果表明，在室内常温（24～29℃）、静水条件下，倒刺鲃对5种药物的急性毒性大小依次为：孔雀石绿〉硫酸铜〉高锰酸钾〉二溴海因〉敌百虫，安全浓度分别为0．05、0．41、0．43、3．76、5.00mg／L。孔雀石绿对倒刺鲃的毒性最大且安全浓度较低；敌百虫和二溴海因毒性最弱，可以考虑作为倒刺鲃疾病防治的适用药物。     

罗非鱼海豚链球菌PCR检测方法的建立

近年来，海豚链球病已给我国及世界罗非鱼养殖带来了巨大的经济损失。为建立特异、敏感、快速的罗非鱼海豚链球菌PCR诊断方法，根据NCBI数据库已公布的海豚链球菌基因序列，设计合成种特异性引物CM1／CM2，进行海豚链球菌特异基因片段的PCR扩增试验、反应条件的优化及不同检测材料的比较。同时测试了方法的特异性和敏感性，对不同养殖鱼场的10份临床样品进行了检测。试验结果表明，引物CM1／CM2可以扩增到与预计大小相符的870bp海豚链球菌特异性基因片段；PCR反应与鮰爱德华氏细菌、Ⅰ型荧光假单胞菌、点状产气单胞菌点状亚种、鳗弧菌、温和气单胞菌、肠型点状产气单胞菌、柱状黄杆菌、嗜水气单胞菌和河弧菌水产常见病原菌均无交叉反应；能够检测的最低细菌数为20～30个海豚链球菌；同时，该PCR可以直接从病鱼的脑、肝脏、肾脏及脾脏组织扩增出特异性目的片段；临床菌株检测结果与基于菌株16srRNA基因序列系统进化分析结果一致。由于病鱼内脏组织总DNA、菌落及菌液可直接用于该PCR扩增，最大限度缩短了整个检测时间及降低了检测成本。方法的建立为致病性海豚链球菌检测提供了一种简便、快速的途径，具有较好的应用前景。     

罗非鱼免疫前后白细胞cDNA差减文库的构建及鉴定

为筛选罗非鱼链球菌疫苗免疫前后白细胞表达变化基因及探讨鱼类白细胞免疫机理,利用抑制性差减杂交(SSH)技术,以链球菌疫苗免疫前后罗非鱼白细胞cDNA为材料,构建了罗非鱼免疫前后正、负2个cDNA差减文库,并采用地高辛(DIG)标记差减文库cDNA作为探针,进行差异表达片段的筛选鉴定。结果显示:2个文库重组率均在90%以上,插入片段在300～900 bp,接头连接效率超过50%,差减效率非常高效,阳性率均超过70%。杂交筛选后正、负文库各挑选30个阳性克隆进行测序组装聚类,正、负文库各获得16和18条非冗余EST(unigene),所得序列经GenBank同源性分析,正、负文库各有10和11条unigene获得功能注释,且各有6和7条unigene没有同源性匹配,为未知新基因。     

广西罗非鱼链球菌病流行菌株PCR鉴定和PFGE基因型分析

为获知近年广西罗非鱼链球菌病流行菌种及其基因型变化信息,采用特异PCR方法对2006-2012年从广西发病罗非鱼分离获得的77株临床菌株进行鉴定,并通过脉冲电场凝胶电泳(PFGE)对2006-2011年分离获得的37株流行菌株进行基因型分析.结果显示,其中20株鉴定为海豚链球菌其余57株鉴定为无乳链球菌.2006-2007年获得的19株流行菌株中有18株为海豚链球菌(94.7％),仅1株无乳链球菌;2009-2012年分离的58株流行菌株中56株为无乳链球菌(96.6％),仅2株海豚链球菌.PFGE图谱聚类显示,海豚和无乳链球菌分别聚类为两个大分支,20株海豚链球菌共产生4种PFGE带型,带型相似度为83.9％～100％;17株无乳链球菌共产生5种PFGE带型,带型相似度为47.4％～100％.研究表明,广西罗非鱼链球菌病流行菌种已从过去(2008年前)以海豚链球菌为主转变为现在(2009-2012年)以无乳链球菌为主;流行菌株PFGE基因型存在多样性.     

三个群体罗氏沼虾线粒体COI基因的遗传多样性分析

运用PCR方法,扩增罗氏沼虾缅甸原种F1代、广西选育群体和江苏养殖群体的线粒体DNA上的细胞色素氧化酶(Cytochrome oxidase subunit I,COI)基因,在此基础上选用10种限制性内切酶对扩增产物进行限制性片段长度多态(RFLP)分析。三个群体共发现2个多态位点,11种酶切图谱,3种基因型。三群体的多态座位比例、平均杂合度和基因型多样性指数分别为:缅甸原种F122.2%、0.0556、0.0472,广西选育群体22.2%、0.0400、0.0398,江苏养殖群体11.1%、0.0106和0.0083,群体间遗传差异未见显著。根据群体间遗传距离构建UPGMA聚类关系图,显示广西选育群体和江苏养殖群体间的遗传关系较近,而与原种F1群体的遗传关系较远。     

鱼鸭混养池塘罗非鱼无乳链球菌病的病原 分离鉴定及其防治

【目的】查明罗非鱼与鸭混养模式下引起罗非鱼发病的主要病原,并探索微生物与中药综合防治的有效方法,为建立安全、高效的鱼鸭混养模式提供科学依据。【方法】从广西南宁市隆安县那桐镇某罗非鱼与鸭混养池塘的发病罗非鱼中取样进行病原菌分离纯化,对获得的纯化分离菌株进行16S rRNA序列测序及人工感染试验和药敏试验,并在药敏试验的基础上采用内服结合外用消毒的方式进行治疗,且在罗非鱼痊愈后使用微生物制剂(成分为芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌和光合菌等)调节池塘水质,同时给罗非鱼投喂微生物制剂和中药(三黄散、肝胆利康散和黄芪多糖)。【结果】引起罗非鱼与鸭混养池塘中罗非鱼发病的病原菌为无乳链球菌(Streptococcus agalactiae),其对罗非鱼的半数致死浓度(LD_(50))为4.7×10~6CFU/mL,对罗红霉素、青霉素、氯霉素、磺胺异恶唑、阿莫西林、利福平、头孢克洛、呋喃唑酮、氟本尼考、头孢氨苄和头孢派酮等抗菌药物高度敏感,对诺氟沙星、庆大霉素和卡那霉素不敏感(耐药)。通过内服氟苯尼考、三黄散、维生素K3和黄芪多糖并全塘泼洒戊二酫与苯扎溴铵混合液及过硫酸氢钾,连续用药14 d后罗非鱼病情基本得到控制。定期泼洒微生物制剂,结合罗非鱼内服微生物制剂和中药的效果良好,即使在高温季节也未出现水质恶化和鱼类发病现象。【结论】引起鱼鸭混养池塘罗非鱼发病的病原菌为无乳链球菌,可采取氟本尼考与三黄散、维生素K3和黄芪多糖联合用药的方法进行治疗。生产上,在鱼鸭混养池塘泼洒微生物制剂及罗非鱼内服微生物制剂和中药,对改善池塘水质及预防疾病发生具有积极作用,能有效降低鱼鸭混养模式下鱼类的发病率。     

致病性鮰爱德华氏菌药敏及中草药提取液体外抑菌试验

采用琼脂扩散法和二倍稀释法测定了31种抗生素和10味中草药及组合对致病性鮰爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)的抑菌作用。结果表明:31种抗菌类药物中,病原菌对头孢克洛、复达欣、头孢噻吩、先锋必、氟哌酸、环丙沙星、氨曲南、恩诺沙星、头孢拉定、头孢克肟、阿莫西林、新生霉素、先锋Ⅴ、氧氟沙星、呋喃妥因、头孢呋肟、头孢氨苄和羧苄青霉素18种药物敏感,对克拉霉素、菌必治、红霉素、林可霉素、多粘菌素B、罗红霉素6种药物表现耐药性。10种中草药水提取物对鮰爱德华氏菌均有不同程度的抑菌作用,其中黄芩水提物的抑菌作用最强,其对鮰爱德华氏菌的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度分别为3.75mg/mL和7.50mg/mL,抑菌圈平均直径达29.17±1.60mm;连翘、大黄、蒲公英、金银花、黄柏有较强的抑菌作用,MIC为7.50～15.0mg/mL,抑菌圈平均直径均在20mm以上;而龙胆草表现出较弱的抑菌作用。     

罗非鱼免疫前后白细胞cDNA差减文库的构建及其表达序列标签初步分析

为筛选得到罗非鱼白细胞免疫相关基因,促进鱼类免疫防治进展,本研究应用抑制性差减杂交（SSH）技术成功构建了罗非鱼链球菌疫苗免疫前后正、反两个白细胞eDNA差减文库,富集了免疫过程中表达谱发生变化的白细胞基因。随机挑选阳性克隆PCR检测。显示插入片段在300～750bp。正反文库各随机挑选300个阳性克隆（共600个克隆）进行测序及EST初步分析。正库筛选得到18个免疫期间袁达丰度上调基因,其中2个与罗非鱼已知基因具有相似性,6个与其他鱼类已知基因相似,其他6个与其他物种已知基因具有相似性,4个为未知新基因。负库筛选得到22个免疫期间表达丰度下调的基因,其中4个与罗非鱼已知基因具有相似性,5个与其他鱼类已知基因相似,6个与其他物种已知基因具有相似性,7个为未知新基因。随着序列的进一步分析及利用RACE等技术得到罗非鱼抗菌或免疫相关全基因,深入开展鱼类功能基因研究奠定良好的基础。     

罗非鱼外周血白细胞分离与血细胞指数研究

采用Ficoll-Urografin法探讨了罗非鱼外周血白细胞的最佳分离条件,并通过瑞氏染色和细胞分类计数对罗非鱼外周血血细胞指数进行测定。结果表明:罗非鱼最佳白细胞分离条件为18℃,且细胞分离液的相对密度为1.082;分离前罗非鱼外周血血细胞总数为1.5×109个/mL,红细胞约占65%,白细胞约占35%,其中小淋巴细胞、大淋巴细胞、嗜中性粒细胞和单核细胞比例分别是5.81%、12.79%、12.79%和1.16%;每毫升外周血可分离得到(1.3~1.5)×107个细胞,其中白细胞可达90%以上,用瑞氏染色可明显区分出单核细胞、大淋巴细胞、小淋巴细胞、嗜中性粒细胞和血栓细胞,但嗜碱性和嗜酸性细胞较难分辨,且各类白细胞之间的比例分离前后保持一致。血细胞指数测定显示,单核细胞最大,其次为嗜中性粒细胞和红细胞,淋巴细胞和血栓细胞最小,各类血细胞指数与鲤科鱼类同源性较高。     

罗非鱼源Ⅰa和Ⅰb血清型无乳链球菌可溶性蛋白差异分析

前期研究表明, 罗非鱼Oreochromis niloticus Ⅰa和Ⅰb血清型无乳链球菌Streptococcus agalactiae疫苗之间缺乏交叉保护力, 为了从蛋白分子水平探讨其免疫原性差异的原因, 在提取罗非鱼Ⅰa和Ⅰb血清型无乳链球菌可溶性蛋白后应用二维差异凝胶电泳(two dimension-Difference Gel Electrophoresis, 2D-DIGE)分析其表达差异蛋白点, 应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定这些差异蛋白, 并使用DAVID生物学数据库预测经鉴定后获得的蛋白功能.结果表明: 在2D-DIGE电泳上, Ⅰa和Ⅰb两种不同血清型无乳链球菌具有167个表达差异蛋白点, 对这些蛋白点进行质谱分析获得32种蛋白, 这些蛋白主要与氧化还原反应、 代谢与能量前体物产生、 糖代谢反应等生物学过程有关, 主要参与糖解和糖异生作用、 丙酮酸代谢与脂肪酸生物合成等通路; 对蛋白功能的预测表明, GAPGH、 半胱氨酸合成酶和锰依赖性锰超氧化物歧化酶的功能与免疫和疫苗研发相关.本研究首次证实, 罗非鱼Ⅰa和Ⅰb血清型无乳链球菌存在较多的表达差异蛋白, 部分表达差异蛋白的功能与免疫和疫苗研发相关, 这可能与链球菌免疫原性有直接关系, 但需要进一步地研究和证实.