水牛κ-酪蛋白外显子4基因的克隆及序列分析

本研究根据普通牛的κ-酪蛋白基因设计一对引物,首次成功扩增出了水牛的κ-酪蛋白外显子4基因,并经序列分析,结果表明κ-酪蛋白外显子4基因片段长780 bp。利用GenBank上的Blast进行比较,中国水牛κ-酪蛋白外显子4序列与地中海水牛、牛、牦牛的κ-酪蛋白外显子4序列同源性分别为99.5%、96.4%、95.9%;氨基酸同源性比较,中国水牛、地中海水牛、牛、牦牛均编码260个氨基酸,中国水牛与地中海水牛、牛、牦牛同源性分别为98.9%、92.0%和91.2%。核苷酸和氨基酸序列同源性结果显示,中国水牛和地中海水牛κ-酪蛋白基因变异不大。但由于在碱基230 bp处发生了一个碱基(A→C)的变化,从而导致其氨基酸也发生了变化,即K(Lys赖氨酸)→R(Arg精氨酸)。本研究为进一步对该基因的功能奠定基础。     

不同品种牛卵泡液对水牛卵母细胞体外受精效果的影响

试验利用水牛卵泡液(BuFF)和黄牛卵泡液(BoFF)对不同来源水牛卵母细胞体外受精效果的影响进行了探讨,以完善水牛体外受精培养系统,进一步提高水牛胚胎体外生产效率。试验按成熟培养液中添加卵泡液替代胎牛血清量共分4个组。不添加卵泡液(0%+10%胎牛血清)为Ⅰ组(对照组);添加5%卵泡液+5%胎牛血清为Ⅱ组;添加10%卵泡液+0%胎牛血清为Ⅲ组;添加15%卵泡液+0%胎牛血清为Ⅳ组。结果表明,添加BuFF对活体采集卵母细胞和屠宰场收集卵母细胞的体外受精卵分裂率无显著影响(P0.05),但添加5%和10%BuFF对卵母细胞体外受精后的胚胎发育有明显促进作用,囊胚率均极显著高于对照组和15%BuFF组(P0.01),5%和10%BuFF组间无显著差异(P0.05);添加15%BuFF囊胚率有降低的趋势,但与对照组相比差异不显著(P0.05)。而添加10%BoFF组活体采集卵母细胞体外受精的受精卵分裂率和囊胚率均极显著高于对照组和5%BoFF组(P0.01),添加5%BoFF组的受精卵分裂率和囊胚率与对照组无显著差异(P0.05);添加BoFF对屠宰场收集水牛卵母细胞体外受精卵分裂率无显著差异(P0.05),但添加5%和10%BoFF组的囊胚率均显著高于对照组和15%组(P0.05),添加15%BoFF组与对照组相比,囊胚率显著降低(P0.05),5%和10%BoFF组间囊胚率无显著差异(P0.05)。综合以上结果,在水牛卵母细胞成熟培养液中添加5%～10%的BuFF或BoFF代替牛血清,可明显提高水牛体外胚胎生产效率,且以添加同种的BuFF效果略好。     

水牛乳能值与乳成分的相关性研究

为了获得水牛乳能值(E,MJ/kg)与乳蛋白质(P)、乳脂肪(F)、乳中总固形物(TSC)及乳糖(L)含量的回归关系,本文对原有测定乳中热晕的方法进行改良,采用经冷冻干燥仪冻干后获得乳粉的方法替代通过烘干获得乳粉的方法,再测定乳中热量,采集泌乳第2周至第11周的原乳样,共采集240份原乳样,资料完整的乳样个数实际为233.测定结果显示,水牛原乳的乳蛋白质、乳脂肪、乳总固形物和乳糖含量及乳能值分别为(4.7±0.2)%、(6.8±0.5)%、(17.0±0.5)%、(5.5±0.2)%和(4.4±0.2)MJ/kg.应用Excel 2003内部函数LINEST求得水牛原乳中乳成分(%)与乳中热量(E,MJ/kg)之间的回归关系如下:E=0.318 1F+0.333 5P+0.085 5L+0.421 6(n=233,R2=0.828 142,P＜0.000 1)、E=0.325 7F+0.326 7P+0.870 9(n=233,R2=0.820 045 86,P＜0.000 1)、E=0.346 781 TSC+0.011 291F-1.446 069(n=233,R2=0.826 169,P＜0.000 1)、E=0.352 496 TSC-1.488 11(n=233,R2=0.825 623,P＜0.000 1).由此可见,水牛乳能值与水牛乳蛋白质、乳脂肪及乳糖含量呈较强的线性回归关系,可通过水牛乳蛋白质、乳脂肪、乳糖及乳总固形物含量预测水牛乳能值.     

饲粮锌、硒和维生素E水平对初产母猪繁殖性能及相关参数的影响

为了研究饲粮微量元素锌、硒和维生素E对初产母猪相关参数的影响规律。本试验选择年龄、体况较一致的二元杂(长白×约克)初产母猪27头,采用L9(34)正交表安排试验,共9个试验组,每组3次重复。饲粮锌、硒和维生素E均设置3个水平,分别为:锌(45 0mg/kg、85 0mg/kg、125mg/kg);硒(0 10mg/kg、0 25mg/kg、0 40mg/kg);维生素E(15IU/kg、30IU/kg、45IU/kg),结果表明:(1)饲粮中含锌量125mg/kg、含硒量0 40mg/kg、含维生素E量45IU/kg时,可以获得最多的窝产活仔数,分别为(9 9±1 1)头,(9 9±1 4)头,(10 0±1 2)头;母猪断奶返情时间间隔也最短,分别为176 1h、174 2h、169 6h。(2)初产妊娠母猪血清雌激素浓度在妊娠期保持相对高水平;孕激素妊娠前期保持相对高水平,后期则保持相对低水平,是发挥母猪繁殖潜力的保证。(3)初产母猪喂给含锌量125mg/kg、含硒量0 40mg/kg、含维生素E量45IU/kg的饲粮时,血清尿素浓度最低,表示有更多的蛋白质在母体和胎儿累积。(4)血清GSH-Px活力妊娠后期比妊娠前期低,表示妊娠后期比妊娠前期母体和胎儿代谢过程产生的过氧化物更多。(5)综合所考察的参数显示,初产母猪饲粮中含锌125mg/kg、含硒0 40mg/kg、含维生素E45IU/kg是适宜的使用量。     

健康水牛与患子宫内膜炎水牛子宫内细菌组成的比较分析

应用16SrDNA克隆文库的方法,分别建立健康和患子宫内膜炎水牛子宫内细菌的16SrDNA克隆文库,并通过序列分析和同源性比对确定细菌的系统发育学地位。结果显示,产后14d水牛子宫内的细菌主要属于梭杆菌门(Fusobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)和变形菌门(Proteobacteria)。患子宫内膜炎组(M组)中有38.89%克隆的属于梭杆菌门(Fusobacteria),序列比对分析表明,这些序列和Fusobacterium necrophorum subsp有最高的的相似度(99%)。另外46.67%的克隆属于拟杆菌门(Bacteroidetes),其中Bacteroides heparinolyticus和Porphyromonas levii在这个门中所占比例最大,分别为55.95%和42.86%,属于厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteri)的克隆较少,所占比例分别为7.22%和6.67%,但是这2个门中的细菌种类相对丰富。仅仅只有0.56%属于放线菌门(Actinobacteria)。健康组(H组)中,26.56%的克隆属于梭杆菌门(Fusobacteria),并且和Fusobacterium necrophorum subsp的相似度最高(99%),32.81%的克隆属于Firmicutes,这些克隆中的61.9%与Clostridium cadaveris的相似性最高(≧97%),35.94%的克隆属于Bacteroidetes,其中56.52%的序列与Bacteroides heparinolyticus相似性最高(99%)。克隆中属于Proteobacteria的比例较低(4.69%)。结果表明,Fusobacterium necrophorum subsp、Bacteroides heparinolyticus和Porphyromonas levii可能是引起水牛产后子宫内膜炎的主要致病菌。厚壁菌门细菌Clostridium cadaveris,拟杆菌门细菌Porphyromonas somerae、Bacteroides pyogenes可能有利于子宫内膜的恢复。     

SYBR Green实时定量PCR检测转Fat-1基因水牛体细胞方法的建立

荧光定量PCR是近些年发展起来的一项新技术,可用于检测外源基因的整合拷贝数、临床诊断、食品安全和动物疾病检测等领域,具有广阔的应用前景。本文构建了携带Fat-1基因的标准品质粒,以SYBR Green为荧光染料,进行实时荧光定量PCR反应,建立标准曲线,并结合绝对定量法检测Fat-1基因在水牛耳缘和肾脏成纤维细胞基因组中的整合拷贝数。结果表明,转Fat-1基因的水牛体细胞的Ct值与起始拷贝数对数的回归方程为:y=-3.43x+31.01,R2为0.998 7,反应效率为99.5%,具有良好的重复性。本文建立的这种高效检测水牛体细胞基因组中外源基因拷贝数的方法,为后期转Fat-1基因水牛的表达分析和检测等研究奠定基础。     

ω-3多聚不饱和脂肪酸脱氢酶Fat-1基因打靶的水牛肾脏成纤维细胞的制备

Fat-1基因能协调ω-6多聚不饱和脂肪酸与ω-3多聚不饱和脂肪酸之间的比例,可提高动物体ω-3多聚不饱和脂肪酸的含量,为提升水牛乳品质提供了一个有效的方法。本研究构建了水牛乳腺特异性多位点基因打靶载体,分离和培养了新生胎儿水牛肾脏成纤维细胞。采用电击法转染、克隆环法筛选和纯化了水牛肾脏成纤维细胞克隆,经绿色荧光蛋白表达观察、PCR和DNA序列检测获得了已整合Fat-1基因的细胞克隆,为制备定点整合Fat-1基因的体细胞克隆水牛提供核移植供体。     

水牛免疫乳抑菌试验

用奶水牛免役乳抗体提取物进行抑菌试验 ,免疫乳中的抗体表现出较强的抑菌效力。当提取物中的Ig以终浓度为 1.0 mg/ m L 加入到霍乱弧菌和伤寒杆菌的培养液中时 ,能有效地抑制霍乱弧菌和伤寒杆菌的生长。     

水牛免疫乳抑菌试验

用奶水牛免疫乳抗体提取物进行抑菌试验，免疫乳中的抗体表现出较强制抑菌效力。当提取物中的Ig以终浓度为1.0mg/mL加入到霍乱弧菌和伤寒杆菌的培养液中时，能有效地抑制霍乱弧菌和伤寒杆菌的生长。     

水牛奶双歧酸奶的制作

水牛奶乳汁浓厚，营养丰富，固形物含量高达18%。胡萝卜汁含有丰富的β-胡萝卜素和多种生物活性物质，对人休弄虚作假有抗癌保健作用，还可促进双歧杆菌的生长。把胡萝卜浓缩汁添加到水牛奶中，利用保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌与双歧杆菌共同发酵所制成的酸奶，克服了单一双歧杆菌发酵产生的不良风味与口感，具有清香爽口、细腻圆滑的特点，双歧杆菌活菌数保持了较高的水平，具有很好的保健效果。