绵羊黏膜趋化因子CCL28基因的克隆、序列分析与原核表达

利用同源序列克隆原理设计1对克隆引物,从绵羊结肠黏膜组织提取mRNA,通过RT-PCR获得CCL28基因,将PCR产物克隆、测序,并进行序列分析;再根据克隆的序列设计1对表达引物,用PCR法从重组克隆载体中扩增出含BamHⅠ/XhoⅠ酶切位点的CCL28片段,双酶切后亚克隆至pGEX-4T-1载体,构建重组原核表达载体pGEX-CCL28,转化宿主菌E.coliBL21（DE3）,经IPTG诱导进行表达,SDS-PAGE鉴定。克隆的绵羊CCL28基因包含完整的开放阅读框,克隆片段长444 bp,ORF为387 bp,编码129个氨基酸,与人、小鼠、猪、牛该基因的同源性分别为76.4%、61.4%、84.3%和92.9%,推测的氨基酸序列与人、小鼠、猪、牛的同源性分别为76%、63%、84%和93%,表达的融合蛋白分子量约为39 ku,并以包涵体形式存在。为下一步研究绵羊CCL28的生物学功能奠定基础。     

牛奶中唾液酸的生物学功能研究

牛奶中含有丰富的唾液酸,尤其是在初乳中,它在各种生命活动中起着重要的作用,特别是在细胞与细胞之间的相互作用、神经生长、突触联系、记忆形成等方面.近年来,唾液酸及其衍生物在治疗流感、神经性疾病、炎症、肿瘤等方面有很重要的应用价值.     

干扰素调节因子3基因敲除对伪狂犬病病毒增殖的影响

试验旨在研究敲除干扰素调节因子3 (interferon regulatory factor 3,IRF3)对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)复制的影响。使用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术建立了IRF3基因敲除PK15细胞系。通过构建重组质粒pIRF3-sgRNA,转染至HEK293T/17细胞,收获慢病毒并感染PK15细胞,经嘌呤霉素筛选获得多克隆细胞系,T7酶切鉴定后通过有限稀释法获得PK15-IRF3^-/-单克隆稳定细胞系。为验证敲除IRF3基因稳定细胞系是否构建成功,采用实时荧光定量PCR、Western blotting方法检测PRV相关基因及蛋白的表达,应用荧光显微镜和流式细胞术观察病毒复制情况并进行病毒滴度检测。结果显示,PK15-IRF3^-/-细胞系感染PRV-GFP后PK15-IRF3^-/-细胞荧光强度明显强于PK15细胞。感染PRV野毒(PRV-QXX)后PK15-IRF3^-/-病毒滴度明显强于PK15细胞,PRV的gE蛋白水平明显高于PK15细胞。在mRNA水平检测两种细胞中PRV TK基因的变化也得到相同的结果。进一步研究表明,在感染PRV-QXX后,PK15细胞中IFN-βmRNA会随着时间增加显著增高(P<0.05),但PK15-IRF3^-/-细胞中IFN-βmRNA则无明显变化。上述结果表明,敲除IRF3基因后显著促进PRV的增殖,IRF3在病毒的复制中发挥着重要作用,为伪狂犬病的防控提供了新的方法和策略。     

急性内毒素损伤对奶山羊肝脏营养代谢的影响

本文旨在研究急性内毒素(LPS)损伤对奶山羊肝脏营养代谢的影响,初步探讨其作用机制。选取年龄、体重相近的关中奶山羊母羊18只,随机分为3组,分别作为对照组(CTL组)、试验Ⅰ组(TⅠ组)和试验Ⅱ组(TⅡ组),每组6只。TⅠ组、TⅡ组奶山羊分别按照100和200μg/kg BW的剂量从颈静脉注射LPS注射液30 mL,CTL组奶山羊注射相同体积的生理盐水。在注射后0、1、4、8、12、24 h从奶山羊的颈静脉采血,制备血浆以检测肝脏代谢功能及营养代谢相关指标。结果表明:注射LPS后肝脏代谢功能受到不同程度地损伤。血浆谷丙转氨酶活性平均值,TⅠ组显著高于CTL组(P<0.05),TⅡ组显著低于CTL组(P<0.05);血浆谷草转氨酶活性平均值,TⅠ组显著高于TⅡ组和CTL组(P<0.05),TⅡ组和CTL组之间差异不显著(P>0.05)。随着时间推移,血浆葡萄糖含量在CTL组基本稳定,在TⅠ组和TⅡ组出现较大波动,但其平均值各组间无显著差异(P>0.05)。血浆总蛋白含量平均值TⅠ组、TⅡ组显著低于CTL组(P<0.05)。随着时间的推移,血浆白蛋白含量在CTL组基本稳定,在TⅠ组和TⅡ组逐渐降低,其平均值各组间无显著差异(P>0.05)。血浆尿素氮、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白和胆固醇含量平均值均表现为TⅠ组>TⅡ组>CTL组,除血浆低密度脂蛋白外,其他各指标均表现为TⅠ组、TⅡ组显著高于CTL组(P<0.05)。此外,TⅠ组血浆高密度脂蛋白和胆固醇含量平均值显著高于TⅡ组(P<0.05)。由此得出,LPS可引起肝脏损伤,进而对奶山羊肝脏营养代谢造成影响;LPS对奶山羊肝脏营养代谢的影响与LPS的剂量有关。     

微量元素氨基酸螯合物的研究新进展

微量元素氨基酸螯合物是最近发展起来的第三代饲料添加剂。由于其稳定性好、抗干扰性强、生物效价高等特点，迅速成为饲料行业研究的热点。但由于价格及质量评定等方面的原因，在生产实践中受到了制约。本文结合本实验室的研究，对微量元素氨基酸螯合物作一综述。     

氨基酸螯合锌的应用效果

锌是动物机体内必需的微量元素。但以无机态的形式添加的锌吸收率低,且易和其它微量矿物质元素产生颉颃作用。有机态的锌添加剂主要是以氨基酸和锌为原料螯合而成的氨基酸螯合物,能较好的解决无机态锌在应用上的弊端。     

大豆黄酮对奶牛相关产奶性能的影响

选用4头泌乳约7个月的荷斯坦奶牛,采用前后自身对照方法,对照期饲喂常规日粮,试验期日粮中添加10 mg/kg的大豆黄酮,研究大豆黄酮对泌乳后期奶牛泌乳量、乳成分及乳中激素的影响。结果显示,饲喂大豆黄酮能缓解泌乳后期奶牛产奶量下降的趋势,并在一定程度上提高产奶量;乳蛋白含量显著升高(P<0.01),乳脂率变化不大。激素分析结果表明,乳中T4的含量显著升高(P<0.05),GH,PRL,E2和TSH的含量有升高的趋势,而T3则有下降的趋势。提示大豆黄酮可能通过调节内源性激素水平而间接地影响奶牛泌乳量和乳成分。     

大豆黄酮对泌乳后期奶牛相关乳成分的影响

选用14头产奶水平相近的泌乳后期黑白花奶牛,随机分为对照组、试验组。试验组日粮添加10mg/kg的大豆黄酮,持续30d。结果发现:与对照组相比,试验组奶牛乳蛋白有所升高,乳脂率有所下降。试验第15d乳中GH的含量显著升高(P<0.05),E2、T3和T4的含量均有升高的趋势。提示大豆黄酮可能通过调节内源性激素水平而间接地影响奶牛乳成分。     

绵羊Gastorkine-1基因的克隆与序列分析

基于电子延伸序列,克隆并分析了绵羊Gastorkine-1基因。提取皱胃黏膜组织总RNA,利用设计的引物进行RT-PCR,PCR产物与pMD19-T载体连接后转化E.coliJM109感受态细胞,检测阳性克隆并测序。克隆的绵羊Gas-torkine-1基因长619 bp,编码185个氨基酸,与人、小鼠、猪、牛的同源性分别为82.0%,48.8%,85.4%,96.9%,推测的氨基酸序列信号肽为1~20 aa,BRICHOS结构域为54~150 aa,结构特征与人、小鼠、猪、牛的Gastorkine-1相一致。     

仔猪多胺代谢相关基因的克隆及断奶对其mRNA表达的影响

多胺是一类广泛分布于组织细胞内的天然低分子多价生物活性物质,在动物的消化、营养代谢以及正常生长中发挥重要作用。本实验克隆了猪(Susscrofa)的7个与多胺代谢相关的基因,分别是精氨酸脱羧酶(ADC)、鸟氨酸脱羧酶(ODC)、鸟氨酸转氨酶(OAT)、鸟氨酸脱羧酶抗酶蛋白1~3(OAZ1、OAZ2、OAZ3)及多按调控因子-1(PMF1),基因片段长度分别是1602(GenBank No.EU545649)、1422(GenBank No.EU534186)、1465(GenBank No.EU404089)、874(GenBank No.EU545195)、678(GenBank No.EU545196)、667(GenBank No.EU545197)及703bp(GenBankNo.EU534185),开放阅读框的长度分别是1380、1383、1313、681、568、559和615bp,编码的氨基酸数目分别是460、461、439、227、189、186和205。经过比对分析,猪ADC基因编码的氨基酸序列与人、小鼠的同源性分别为89.7%和87%;猪ODC与人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)和大鼠(Rattus norvegicus)的同源性分别为93.1%、89.8%和90.5%;猪OAT与人、小鼠的同源性分别为91.8%、90.5%和89.8%;猪OAZ1与人、大鼠及小鼠的同源性分别为93.4%、82.5%和83.8%;猪OAZ2与人、大鼠及小鼠的同源性分别为99.5%、98.9%和98.9%;猪OAZ3与人、小鼠和大鼠的同源性分别为90.4%、87.5%和84.2%;猪PMF1基因编码的氨基酸序列与人和小鼠的同源性为84%和70.9%。半定量RT-PCR分析表明,断乳后ADCmRNA的表达量在盲肠和直肠有所增加,其他各组织均有所降低;ODCmRNA的表达量在直肠和盲肠有较大增加,结肠、回肠和空肠的表达量均呈小幅降低;OATmRNA在肾的表达量有明显增加,十二指肠、空肠和回肠都有降低;除了胃,OAZ1mRNA在其他组织表达水平均有所增加;OAZ2mRNA的表达量在所有组织均有不同程度增加,盲肠居首;OAZ3mRNA在肠道组织的表达量均有不同程度增加;PMF1mRNA的表达量在结肠、空肠和回肠与抗酶家族相似,但断乳后有小幅降低。研究结果提示,多胺对仔猪的生长、发育、成熟、适应性和损伤后的恢复具有重要的生物学作用。