绿源素与甜菜碱预防肉鸡球虫病的效果试验

为探讨绿源素与甜菜碱预防肉鸡球虫病的效果,试验选用4种常用的抗球虫药物及绿源素与甜菜碱组合进行对比试验。以抗球虫指数(ACI)、病变值、卵囊数及粪便记分为试验指标,进行综合评价。试验结果表明,绿源素单独使用平均抗球虫指数为149.06,盲肠病变值降低56.48%,盲肠卵囊数减少72.52%,平均粪便记分降低44.52%;绿源素与甜菜碱配合使用平均抗球虫指数为171.95,盲肠病变值降低76.85%,盲肠卵囊数减少75.26%,平均粪便记分降低74.93%。绿源素单独使用的抗球虫效果低于绿源素与甜菜碱配合使用的抗球虫效果,绿源素与甜菜碱配合使用的抗球虫效果达中等以上有效水平。     

猪圆环病毒2型ZJ/C株增殖条件的优化

为了在PK15细胞上获得更高滴度的猪圆环病毒2型(PCV2)ZJ/C株,本实验优化了细胞接种密度、接毒方法、接毒量与收获时间和冻融次数等条件。结果表明接种密度在2.5×10~5个/m L,同步接毒加D-氨基葡萄糖处理,接毒量为2%,接毒后90h收获,-20℃冻融2次,PCV2-ZJ/C株增殖效果最好。该结果为猪圆环病毒2型灭活疫苗(ZJ/C株)的生产提供了依据。     

捻转血矛线虫ZJ株24000分泌排泄(ES)蛋白基因的克隆和序列分析

通过 RT- PCR方法 ,从捻转血矛线虫成虫总 RNA中扩增得到特异性片段 ,并把这一基因片段克隆到 p U C18克隆载体上 ,进行测序及同源性比较。序列分析可知 ,其核苷酸序列与国外已发表的 2 4 0 0 0分泌排泄抗原基因的同源性为 99.2 %。表明本试验成功提取了捻转血矛线虫成虫总 RNA,并用 RT- PCR方法克隆了 2 4 0 0 0分泌排泄抗原基因 ,为该基因的表达及其免疫学作用研究奠定了基础     

鸡柔嫩艾美耳球虫ZJ株5401基因在大肠杆菌中的表达

根据E．tenella子孢子表面抗原5401基因序列设计合成特异性引物，引物两端分别加上EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点及保护碱基，用RT-PCR方法从E．tenella孢子化卵囊扩增出881bp的片段。将重组克隆质粒pGEM-T5401用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后，电泳回收目的片段，克隆到同样经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切的表达载体pET-30a中，得到重组表达质粒pET-30a-5401，把重组表达质粒转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导，表达出了His-5401融合蛋白。Western印迹结果表明表达产物为大约66．2ku的蛋白。     

牛附红细胞体病PCR诊断方法的建立

根据已报道的牛附红细胞体16S rRNA的序列设计1对特异性引物,进行PCR.将PCR产物克隆并测序,结果显示所得基因片段为667 bp,与GenBank上Mycoplasma weyonii序列同源性达到98.83%.试验建立的PCR诊断方法特异性强,与健康牛血液、牛无乳链球菌、金黄葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、大肠杆菌的DNA无交叉反应,能检测的牛附红细胞体最低DNA质量浓度是13.6 ng/L.应用该方法对130个奶牛血样进行牛附红细胞体病检测,结果表明总阳性感染率为24.62%.该方法具有快速、准确、敏感等特点,为牛附红细胞体病的诊断及分子流行病学的调查提供新的手段.     

快速检测牛巴贝斯焦虫LAMP方法的建立

为提高牛巴贝斯焦虫(Babesia bovis)病检出率,本研究采用环介导等温扩增技术(LAMP)建立一种快速、灵敏、特异的检测B.bovis的方法。根据GenBank中登录的B.bovis细胞色素b基因(cyt b)序列,设计4条LAMP引物,优化反应体系条件,在Bst DNA聚合酶的作用下,62℃反应60min,加入EvaGreen后,肉眼观测。结果表明,该LAMP检测体系特异性强,与双芽巴贝斯焦虫(B.bigemina)DNA等不发生交叉反应;敏感性高,最小检测值为0.014fg(相当于1.58×10-3虫体的拷贝数),为一般PCR方法的1000倍。该方法具有简单、快速、低成本的特点,可用于B.bovis病的现场快速检测。     

捻转血矛线虫ES24抗原基因的原核表达及其免疫诊断的应用

将ES24基因从pUC18-ES24重组质粒中亚克隆到pET-30a原核表达载体上,构建重组表达质粒pET-30a-ES24,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE电泳和Western-blot分析表明,表达蛋白相对分子质量约为30 000,可被6×His抗体和捻转血矛线虫阳性血清所识别。纯化后的重组表达蛋白作为诊断抗原具有良好的免疫反应性和特异性,可用作免疫诊断试剂。     

鸡柔嫩艾美耳球虫ZJ株TA4基因的克隆及原核表达

本试验对E．tenella ZJ株的TA4基因进行了克隆和表达。根据已报道的柔嫩艾美尔球虫TA4基因序列设计引物,以孢子化卵囊总RNA为模板,用RT—PCR的方法扩增得到一特异片段,将扩增产物克隆至pMD18-T,转化DH5-α感受态,经酶切鉴定获得阳性重组质粒并对其进行测序。测序结果与参考序列比较,核苷酸同源性为99．1％。然后将重组质粒和表达载体pGEX-4T2分别以EcoR I、Xho I酶切后构建重组表达载体pGEX—TA4,并将其转化入大肠杆菌BL21中,提取质粒经酶切和PCR鉴定正确后,用IPTG诱导表达。表达产物经SDS—PAGE和Western blot检测显示,TA4基因在大肠杆菌中获得表达;融合蛋白的分子量约为43ku,以包涵体形式存在;诱导6h的蛋白表达量可达到35.9％,采用抗GST抗体进行Western blot,成功检测到了该特异性条带。     

中药对人工感染IBDV鸡产生免疫抑制的调节作用

２２０只非免疫鸡随机分为Ａ,Ｂ,Ｃ,Ｄ,Ｅ５组,每组４４只。Ａ组给中药２次,Ｂ组５次,Ｃ、Ｄ、Ｅ组不给中药。于１４日龄对Ａ,Ｂ,Ｃ组人工感染传染性法氏囊病毒（ＩＢＤＶ）,于２１日龄对Ａ,Ｂ,Ｃ,Ｄ组接种新城疫（ＮＤ）Ⅱ系疫苗,于４６日龄每组随机抽取１５只鸡均攻ＮＤ强毒。结果表明：攻ＩＢＤＶ后一周,Ｃ组的死亡率显著高于Ａ组和Ｂ组（Ｐ〈０．０５）,新城疫Ⅱ系苗免疫后,Ｂ组鸡新城疫血凝抑制（ＨＩ）抗体效     

减毒沙门氏菌为载体传递鸡球虫DNA疫苗的安全性、稳定性与免疫原性

将携带鸡柔嫩艾芙耳球虫5401基因的真核表达质粒pcDNA3—5401的减毒沙门氏菌ZJ111菌株（ZJ111／pcDNA3—5401）口服接种于3日龄非免疫鸡，2周后进行第2次接种。结果表明．利用该减毒沙门氏菌作为戴体具有相对安全性，用限制性酶切分析和PCR鉴定证实，体内试验和体外培养的重组质粒在受体菌ZJ111菌株内比较稳定。用ZJ111／pcDNA3—5401（10^4cfu）口服接种非免疫鸡．2周后用相同剂量加强免疫1次，二免后2周用柔嫩艾笑耳球虫孢子化卵囊攻击，观察其免疫效果。结果表明，重组ZJ111／pcDNA3—5401菌既能诱导产生抗鸡柔嫩艾芙耳球虫抗体，也能显著增强淋巴细胞增殖水平（P〈0．05）；其抗球虫指数为164．98。试验结果显示，利用减毒沙门氏菌为戴体传递DNA疫苗具有良好的安全性、稳定性和免疫原性。