猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点的克隆及原核表达载体的构建

【研究目的】对猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点进行克隆和原核表达载体的构建。【方法】参考GenBank上公布的TGEV S基因A抗原位点序列,应用Primer6.0设计一对含酶切位点的引物,用于RT-PCR扩增A抗原位点目的片段,将扩增产物连接于paesy-T克隆载体上构建克隆载体,用EcoR I和Xhol I对表达载体PET-32a（+）和重组质粒进行酶切,将酶切产物亚克隆至PET-32a（+）多克隆位点上,连接、转化至BL21(DE3),构建A位点的原核表达载体,并对阳性重组质粒进行酶切、PCR和测序鉴定。【结果】所扩增的目的片段的大小为534bp,与原核表达载体连接后,经核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因与其它猪传染性胃肠炎病毒相应基因具有很高的同源性,说明成功地构建了TGEV S 基因A抗原位点的原核表达载体。【结论】TGEV S 基因A抗原位点原核表达载体的成功构建,填补了中国国内单独针对此位点进行研究的空白,也为TGEV诊断方法的建立提供良好的技术基础。     

猪源SLPI对小鼠皮肤损伤愈合的效果

【目的】探究猪源分泌性白细胞蛋白酶抑制因子(Secretory Leukocyte Protease Inhibitor, SLPI)对皮肤创伤愈合过程中的治疗效果,以开发其潜在的使用价值。【方法】使用重组表达的猪源SLPI处理小鼠创伤,筛选蛋白的最佳作用浓度,再以此浓度探索其抗损伤愈合情况。设置创伤组、SLPI处理组及阳性药对照组(阳性药物为百灵金方抑菌液),观察不同时间大体病理变化与显微病理变化,对创伤愈合进行临床评分,来评判SLPI对伤口恢复的影响作用。【结果】结果显示,SLPI最佳作用浓度为0.25 mg/mL。三组小鼠创伤溃疡面随时间延长均逐渐减小;与创伤组相比,从第3天开始,SLPI处理组病理打分均低于创伤组(P<0.05或P<0.01),而与阳性药组表现接近(P<0.05);在第7天,阳性药组和SLPI组均可观察到毛囊生长,但创伤组变化不明显。显微病理变化显示,SLPI组和阳性药组在第5天可观察到表皮层和皮脂腺,在第7天成纤维细胞数量明显较多,炎性细胞浸润减少。【结论】重组表达的猪源SLPI对小鼠皮肤创伤愈合有一定效果,为开发针对猪体皮肤损伤有效药物提供...     

磺胺甲噁唑抗原合成及其抗体的制备

采用重氮化法将磺胺甲噁唑(SMZ)与人血清白蛋白偶联形成免疫原,免疫大白兔制备多克隆抗体。通过紫外扫描和高效液相色谱分析偶联物,免疫抗原的偶联率为19∶1,改良辛酸-饱和硫酸铵纯化抗体,多克隆抗体效价达1∶105,间接酶联免疫吸附试验建立的SMZ检测的线性范围在0.1ng/mL~10μg/mL之间,50%抑制率检测限为22.53ng/mL,抗体与磺胺甲噁唑交叉反应率为100%,与其他7种磺胺药交叉反应率很低。表明制备的磺胺甲噁唑多克隆抗体具有很高的特异性,可用于SMZ在动物性产品中残留的检测。     

嗜水气单胞菌胞外蛋白酶ECPase54的纯化及特性分析

嗜水气单胞菌（Ａｈ）Ｊ－１株的液体培养物上清在５６℃或与乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ）或丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（ＰＭＳＦ）作用，其胞外蛋白酶（ＥＣＰａｓｅ）的活力有不同程度的下降，将酪蛋白掺入丙烯酰胺聚合后，加Ａｈ－Ｊ－１上清作ＳＤＳ－ＰＡＧＥ３７℃原位消化，染色，显示上清中存在至少５种分子量不同的蛋白酶，ＡｈＪ－１株的培养上清经硫酸铵沉淀，ＤＥＡＥ－纤维素离子交换层析和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２０     

加味葛根芩连汤对湿热泄泻仔猪肠道炎症和损伤修复的作用

通过用加味葛根芩连汤治疗仔猪的湿热泄泻,探讨其对湿热泄泻仔猪肠道的修复作用.选取8～15日龄未断奶仔猪(大白×长白)30头,其中健康仔猪6头,为对照组;有粪色黄褐而臭、小便短赤、舌质红等症状的泄泻仔猪24头,分为湿热泄泻组、加味葛根芩连汤低剂量组、加味葛根芩连汤中剂量组和加味葛根芩连汤高剂量组,每组6头.对照组和湿热泄...     

猪传染性胃肠炎病毒S基因B、C位点的克隆及原核表达载体的构建

参考GenBank上公布的猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）S基因B、C抗原位点序列,应用Primer6．0设计一对含酶切住点的引物,用于RT—PCR扩增B、C抗原位点目的片段,将扩增产物连接于peasy—T克隆载体上,构建克隆载体,用EcoRⅠ和XhoⅠ对表达载体PET-32a（＋）和重组质粒进行酶切,将酶切产物亚克隆至PET-32a（＋）多克隆位点上,连接、转化至BL21（DE3）,构建B、C位点的原核表达载体,并对阳性重组质粒进行酶切、PCR和测序鉴定。所扩增的目的片段的大小为357bp,与原核表达载体连接后,经核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因与其他猪传染性胃肠炎病毒相应基因具有很高的同源性,说明成功地构建了TGEVS基因B、C抗原位点的原核表达载体。TGEVS基因B、C抗原位点原核表达载体的成功构建,为TGEV诊断方法的建立提供良好的技术基础。     

猪圆环病毒2型感染对猪小肠上皮细胞Claudin-1蛋白和闭锁小带蛋白-1基因mRNA表达的影响

紧密连接在维持肠道黏膜完整性和免疫系统正常发挥功能中作用重大。【目的】旨在探讨猪圆环病毒2型(PCV2)感染对猪小肠上皮细胞(IPEC)紧密连接的影响。【方法】利用基因克隆获得Claudin-1蛋白和闭锁小带蛋白-1 (ZO-1)基因的重组质粒并建立荧光定量RT-PCR标准曲线;利用所建立的方法检测PCV2感染的IPEC中Claudin-1蛋白和闭锁小带蛋白-1mRNA的动态变化。【结果】构建的两种紧密连接蛋白基因的重组质粒荧光定量RT-PCR标准曲线线性关系良好,相关系数均达0.99以上。PCV2感染的IPEC中Claudin-1蛋白和ZO-1mRNA表达在4、12、24、48、72h均显著下降。【结论】PCV2感染可抑制猪小肠上皮细胞紧密连接蛋白相关基因的表达,破坏细胞间的紧密连接,增加肠道通透性。     

猪IL-4、IL-6和IL-10 SYBR Green Ⅰ real-time PCR检测方法的建立及应用

为探讨PRRSV感染后机体的体液免疫应答、从分子水平深入研究PRRSV的免疫机制,本研究针对Th2型细胞因子IL-4、IL-6、IL-10以及看家基因β-actin的基因序列分别设计一对特异性引物,构建含有各自引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测IL-4、IL-6、IL-10及β-actin的SYBR Green Ⅰ real-time PCR方法。该方法线性关系好,各种细胞因子及β-actin标准曲线的相关系数均达到0.997以上;敏感性高,初始模板的检出下限均达到1×101copies/μL;特异性强,扩增产物形成单一的特异性熔解峰;重复性好,组内与组间的变异系数均小于3%。应用所建立的方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染仔猪外周血单个核细胞(PBMC)中IL-4、IL-6和IL-10mRNA的表达水平进行了检测。结果表明,本研究建立的real-timePCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可以用于猪Th2型细胞因子的检测及定量分析。     

猪血源树突状细胞诱导培养与鉴定

摘要：【目的】规范DCs诱导培养和鉴定的方法,为研究相关病毒致病机制、制定相应的治疗与预防措施奠定技术平台。【方法】分离猪外周血单个核细胞（PBMCs）,贴壁细胞经一定浓度GM-CSF和IL-4诱导,不同时间观察形态变化,7天后收集所诱导的细胞,经光镜、流式细胞术及激光共聚焦显微镜鉴定其形态、表面标志物CD1a/SWC3a;利用双色流式细胞术检测DC MHC-II分子和CD80/86表达情况。【结果】试验结果显示,所诱导的细胞具有典型树突状形态;其表面CD1a/SWC3a双阳性率达到90.1%,MHC-II/CD80/86分子双阳性率达98.3%;激光共聚焦显微镜观察细胞呈集落状,细胞表面CD1a/SWC3a双阳性,表明已经成功诱导出猪血源DC,并获得诱导的标准程序,为研究以DC为靶细胞的猪病毒性疾病免疫致病机理奠定基础。     

PCV2感染猪皮肤源树突状细胞内源性抗原加工提呈相关分子转录水平的变化

用猪圆环病毒2型（PCV2）感染40日龄健康长白仔猪,于感染后3、7、14、21和35天宰杀,收集皮肤源树突状细胞（DC）。利用实时荧光定量PCR技术对感染仔猪皮肤源DC内源性抗原加工提呈相关分子（LMP7,UBP,MHC-I,calreticulin）mRNA水平的变化进行定量分析。结果显示,LMP7转录水平在感染后3天显著下调（P < 0.05）,UBP转录水平始终上调,其中在21天和35天显著上调（P < 0.05）,MHCⅠ转录水平在7 天显著下调（P < 0.05）,calreticulin转录水平虽有所上调,但差异不明显。以上结果表明,PCV2在感染早期可抑制猪皮肤源DC内源性抗原加工提呈能力。