柑橘衰退病毒基因RNAi载体的构建

基于转化病毒基因介导抗性,通过在植物表达载体p CAMBIA 2301上插入启动子–内含子–终止子的方式,构建一种含有发夹结构的、通用型强的RNAi载体骨架结构;以柑橘衰退病毒(citrus tristeza virus,CTV)的p25、p20和p23基因保守序列为模板设计正向片段和反向片段,先后与骨架载体连接,成功构建了3个RNAi载体(分别命名为ds2301–p25、ds2301–p20和ds2301–p23),并将载体ds2301–p23注射入墨西哥莱蒙叶片。制作p23基因的地高辛标记探针,用Northern杂交检测是否有si RNA产生。结果表明:用Northern杂交可以检测到p23特异的si RNA,在墨西哥莱蒙叶片中瞬时表达的农杆菌ds2301–p23可以发生RNAi,表达有效的si RNA。本研究中构建的骨架载体可以广泛用于RNAi载体的构建,含有柑橘衰退病毒基因片段的3个载体可以用于基因功能分析及具有CTV抗性的柑橘种质资源获得。     

番茄组织总RNA提取方法研究

从RNA的完整性、纯度和产量等方面比较了TRIzol,RNAplant,TRIpure等3种RNA提取试剂对番茄不同组织部位总RNA的提取效果.结果表明,RNAplant能从成熟组织中获得较高质量和产量的总RNA,用该方法提取的番茄老化组织总RNA经RT-PCR能成功进行内参检测.     

辣椒组织总RNA提取方法研究

从RNA的完整性、纯度和产量等方面比较了3种RNA提取试剂对辣椒不同组织部位RNA的提取效果。结果表明,RNAplant能从成熟组织中获得较高质量和产量的RNA,用该方法提取的辣椒老化组织RNA经RT-PCR能成功进行内参检测。     

影响柑桔生产者价格变动的主要因素分析

柑桔产业作为全球和中国最大水果产业,是我国南方农村经济重要的支柱产业,柑桔生产者价格直接关系到产业效益和稳定.探明影响柑桔生产者价格变动的因素及其权重,有利于维护合理平稳的柑桔生产者价格、保障柑桔产业的效益.本文分析了近期柑桔产业的状况和影响柑桔生产者价格变动的主要因素.通过数据分析和案例分析,认为柑桔生产者价格的变动...     

湖南省葡萄扇叶病调查及检测研究

对湘西北、湘南、湘中和湘西等葡萄主产区的扇叶病发病及危害情况进行了调查,并通过生物学和分子生物学的方法对各地区的疑似病株进行了检测。结果表明：在湖南的葡萄主产区,葡萄扇叶病的感病品种较多,在夏黑无核、红地球、金星无核和金手指等品种上均有发生,但湘西的刺葡萄表现出对葡萄扇叶病有一定的抗性;感病症状总体上表现为叶片褪绿、黄化,叶缘锯齿变尖锐或形状不规则,并严重影响葡萄植株的生长,导致树势减弱、产量下降、果实品质变差;生物学检测结果显示,采集的54个样品,其中有52%的样品在千日红和本氏烟草上表现出系统性斑驳和变形;而分子生物学检测结果显示,54个样品中有29个样品检测到葡萄扇叶病病毒,以金星无核和红地球两个品种的检出率较高。     

番茄抗溃疡病品种的转育与SSR鉴定

番茄溃疡病是危害番茄生产的主要病害之一,抗病育种是解决该病害的最佳途径。以感病番茄98-1为母本、茄科茄属龙葵为父本进行杂交育种,经过四代回交和一代自交,获得了对番茄溃疡病具有抗性的杂交后代群体,并通过SSR鉴定得到了1个与番茄溃疡病抗性相关的SSR标记-CAT01。     

崀丰脐橙的选育及其耐贮性研究

丰脐橙是从华盛顿脐橙( Citrus sinensis( L) osbeck)中选育出优良芽变品种。该品种遗传性状稳定,综合性状优良。丰脐橙属中晚熟品种,品质上等,早果性、丰产性、稳产性、耐贮藏性好,适应性强,适合在南方各省推广栽培。     

毒蛇的人工养殖

毒蛇的全身是宝,经济价值高,而且养蛇本小利大,市场广阔.毒蛇的人工养殖已成为一门新兴的养殖业.现将毒蛇的人工养殖技术介绍如下:     

柑桔容器育苗

柑桔苗木是发展柑桔生产的基础,培育品种纯正、生长健壮、根系发达、无检疫对象或病毒病的优质苗木,是柑桔育苗的主要任务。目前,生产上多用露地育苗的方式培育嫁接苗。但按照国内外发展的趋势,容器育苗是培育无毒苗的发展方向。容器育苗育成的苗木可带原土,减少定植时根系损伤     

柑橘衰退病毒基因p23 RNAi载体的构建及转化

【目的】构建柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)含p23的RNAi载体,以获得具有抗性的柑橘转基因植株。【方法】基于转化病毒基因介导抗性,根据NCBI公布的CTV基因组序列,查找p23保守序列,设计并克隆两条不同长度的片段。对两条片段和植物表达载体p BI 121进行双酶切和连接来构建RNAi载体。初步预测所构建的载体发生RNAi抗病毒的可行性。利用农杆菌介导的瞬时表达技术将含RNAi载体的农杆菌注射入CTV指示植物墨西哥莱蒙的叶片,利用GUS组织化学染色法观察叶片中载体发生瞬时表达的情况。发生瞬时表达的叶片接种CTV T36基因型,利用酶联免疫反应(ELISA)检测病毒含量。同时,提取叶片的RNA并反转录为c DNA,利用实时荧光定量PCR(q-PCR)检测CTV p20,通过该基因的表达量反映叶片中的病毒含量。通过农杆菌介导的遗传转化将RNAi载体转入大红甜橙实生苗上胚轴节间茎段,抗生素筛选得到的芽嫁接至枳橙实生试管苗。提取大红甜橙叶片的DNA,通过PCR扩增确定其是否为转基因阳性;目的基因检测为阳性的植株二次嫁接至温室保存的酸橙实生苗;根据插入的p23基因序列设计q-PCR引物,检测转基因植株中p23的表达情况。取CTV T36基因型寄主的带皮芽,用腹接法接种大红甜橙转基因植株。取接种后新萌发枝梢上的叶片,用检测瞬时表达叶片同样的方法分析植株的抗病性。对于第1次接种后未检测出病毒感染的植株,进行第2次接种并检测分析。【结果】克隆得到CTV p23 513 bp的长片段和291 bp的短片段,与载体p BI121连接后成功构建含发夹结构的来自病原且能靶向目的基因的RNAi载体,命名为p23-RNAi。注射p23-RNAi的墨西哥莱蒙叶片经GUS染色后能够产生蓝色斑点,表明农杆菌p23-RNAi可以在叶片中发生瞬时表达;接种CTV后第15和30天,瞬时表达p23-RNAi的墨西哥莱蒙叶片ELISA检测结果均为阴性,同时q-PCR检测结果显示其CTV p20的积累水平和增加速度明显低于对照植株,表明瞬时表达的p23-RNAi在一定时间内可以对CTV的侵染产生抑制。p23-RNAi经农杆菌介导遗传转化大红甜橙获得抗性芽,通过普通PCR的扩增结果证明得到7个转基因植株;q-PCR检测结果进一步表明7个转基因植株间p23的含量呈现一定差异,植株E的含量最高,其次是C、F、H、A、B和G。接种CTV后,p20的表达量在7个转基因植株间也表现出一定差异,表达量最高的是植株A,其次是G、F、E、B、H、C,且与对照植株相比,呈现不同程度的抗病性。转基因植株对病毒的抗性与外源基因的表达水平没有相关性,外源基因表达水平最高的植株E并没有表现强的CTV抗性。经过两次病毒接种,转基因植株C在接种后具有完全抗性。【结论】p23-RNAi载体能引起植物抗柑橘衰退病毒;瞬时表达技术可快速鉴定RNAi载体的抗病性,有利于筛选高效率的RNAi载体。