无毒性产气荚膜梭菌ε毒素突变体的表达及免疫保护力评价

【目的】获得产气荚膜梭菌ε毒素（ETX）的无毒重组突变体,并评价其毒力及免疫原性。【方法】对已知的D型产气荚膜梭菌ETX编码基因按照大肠杆菌偏爱密码子进行优化设计。同时,将第106位的组氨酸和第199位的苯丙氨酸分别突变为脯氨酸和谷氨酸,经人工合成,获得基因片段GETX_m2。将GETX_m2克隆至原核表达载体pET30a-(＋)后,将pET30a-GETX_m2转化至BL21（DE3）感受态细胞中,在15℃和37℃两种条件下分别用IPTG诱导16 h和4 h,超声破碎后收集上清和沉淀,采用SDS-PAGE和Western blot方法检测重组蛋白的表达情况及其可溶性。利用Ni-IDA亲和层析方法对可溶性表达的重组蛋白进行纯化,从而获得重组蛋白rETX_m2。利用Western blot方法,检测rETX_m2与D型产气荚膜梭菌ETX抗血清的反应性。将rETX_m2用细胞维持液稀释至100及10 μg·mL^-1,检测其对犬肾细胞系（MDCK细胞）的毒力。分别用胰酶活化前和活化后的rETX_m2,以0.0625、0.625和6.25 mg·kg^-1 3个剂量尾静脉注射,检测rETX_m2对小鼠的毒力。随后,将rETX_m2与Montanide ISA 201佐剂混合乳化制备疫苗,取4只健康家兔,皮下免疫2次（间隔两周）,100 μg/只。同时,Montanide ISA 201佐剂与PBS混合液免疫组作为对照组。分别在一免后14 d以及二免后21 d,采血,分离血清,按照《中华人民共和国兽药典》（2015年版）规定的方法检测血清对D型产气荚膜梭菌毒素的中和抗体效价。同时,在二免后21 d,对家兔经耳缘静脉注射1个家兔MLD的D型产气荚膜梭菌毒素,检测rETX_m2对家兔的免疫保护效果。【结果】 在15℃和37℃条件,rETX_m2在BL21（DE3）菌体中均以可溶性和包涵体两种形式表达,综合考虑重组蛋白的表达量、可溶性及诱导时间,选择纯化在37℃条件下诱导获得的可溶性rETX_m2。灰度扫描结果显示,在37℃诱导条件下,rETX_m2可溶表达比例达30%;Western blot检测结果表明,D型产气荚膜梭菌毒素抗血清能够特异性的识别rETX_m2,出现特异性反应条带。MDCK细胞毒性实验显示,在rETX_m2浓度为100 μg·mL^-1的细胞培养基中孵育24 h后,细胞未出现细胞病变,而2 000倍稀释的D型产气荚膜梭菌天然毒素细胞培养基孵育组的细胞出现了明显的细胞病变;小鼠安全试验显示,尾静脉注射6.25 mg·kg^-1剂量的rETX_m2,对小鼠无致死性;血清中和试验结果显示,rETX_m2免疫组每毫升的一免兔抗血清可中和450-750个小鼠MLD,每毫升的二免兔抗血清可中和2 500-4 000个小鼠MLD的D型产气荚膜梭菌毒素,而对照组的兔抗血清对D型产气荚膜梭菌毒素无中和作用;用1个家兔MLD的D型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组家兔4/4死亡,免疫组家兔4/4保护。【结论】产气荚膜梭菌rETX_m2毒力基本丧失,但保留了良好的免疫原性,是D型产气荚膜梭菌病基因工程亚单位疫苗的理想候选抗原蛋白。     

韶关农业气候资源与蚕桑生产的关系分析

一、概论:韶关市的蚕桑生产历史悠久,据史书《汉书,地理》记载,汉武帝鼎元年(公元前116年),连州的女子已进行“桑蚕织绩”和“采桑饲蚕”的种桑、养蚕、丝织的生产活动了。解放后北江沿岸中上游的英德、阳山、连县、翁源、乐昌、曲江等县先后发展了蚕桑生产。1958年有桑地约3000多亩,产茧35吨多。1978年桑地面积才发展到4200多亩,产茧173.3吨。十一届三中全会以后,各项农村政策得到落实,蚕桑生产也有较大幅度的发展。1986年桑地面积达8万6千多     

以猪粪为原料的有机肥改良橘园土壤效果及安全性评估

2017~2019年连续3年在橘园施用以猪粪为原料生产的有机肥,研究分析其对橘园土壤的改良效果,同时对使用安全性进行评估。通过分析,施用以猪粪为原料生产的有机肥可以显著提高土壤pH、阳离子交换量及有机质、碱解氮、有效磷、速效钾的含量;土壤有效钙、有效镁、有效锌、有效铜、有效硼、有效硫含量也显著提高。不同处理土壤中重金属砷、铅、镉、铬、汞总量没有显著性差异,铜、锌总量随着有机肥用量的增大而提高,没有检出土壤中含土霉素、强力霉素;柑橘果实中重金属砷、铅、镉、铬、汞总量没有显著性差异,铜、锌总量随有机肥用量而增高,抗生素未检出。     

猫传染性腹膜炎病毒N蛋白在昆虫细胞-杆状病毒系统中的表达与鉴定

本研究旨在利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达猫传染性腹膜炎病毒（Feline infectious peritonitis virus,FIPV）N蛋白,并制备抗该蛋白的多克隆抗体,用于FIPV临床抗原/抗体诊断及N蛋白功能研究。参考GenBank中FIPV的N基因序列,选择FIPV毒株N基因（登录号：KC461235.1）,并对该N基因进行密码子优化、基因合成,酶切后将N基因连接至pFastBac1载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经氨苄西林抗性筛选阳性克隆,提取质粒经酶切及测序鉴定正确后,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选及PCR鉴定后,最终成功构建重组杆状病毒质粒Bacmid-N,转染Sf9细胞包装杆状病毒,于28 ℃温箱培养4 d后收集感染Sf9细胞上清,并通过镍离子亲和层析纯化获得重组N蛋白。经SDS-PAGE及Western blotting鉴定结果表明,本研究成功利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达出大小约为51 ku的FIPV重组N蛋白。将该蛋白与弗氏佐剂按一定比例混合后,免疫6周龄BALB/c小鼠。用间接ELISA方法检测小鼠血清抗体效价可达1：102 400;利用Western blotting和间接免疫荧光试验对N蛋白多克隆抗体进行检测分析,结果表明,真核表达的重组蛋白免疫原性良好,多克隆抗体具有良好的反应原性,可特异识别FIPV感染细胞。本研究为FIPV抗原/抗体诊断试剂盒的研发奠定了基础。     

产气荚膜梭菌α毒素C末端与中和抗原表位的串联表达及免疫保护性分析

为获得产气荚膜梭菌α毒素(CPA)的C末端(CPAC)与中和抗原表位NE(ARGFAK)的串联融合蛋白并评价其免疫原性,对已知的A型产气荚膜梭菌CPAC及NE的编码基因进行优化设计,并将两个基因的三拷贝序列串联,经人工合成获得基因片段GCPAC3NE3。将该片段克隆至原核表达载体p ET30a(+)中进行表达与纯化,获得重组蛋白。利用Western blot方法检测重组蛋白与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清的反应性。随后,以纯化的重组蛋白免疫家兔,根据《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测家兔血清的中和抗体效价。在二免后21 d,以1个MLD的A型产气荚膜梭菌毒素对家兔进行攻毒。结果表明重组蛋白主要以包涵体的形式存在表达且能与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清反应。每毫升的一免抗血清可中和40个最小致死量(MLD)、二免抗血清可中和80个MLD的A型产气荚膜梭菌毒素;1个MLD的A型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组4/4死亡,免疫组得到了100%(4/4)的保护。以上结果说明,重组蛋白具有良好的免疫原性,从而为A型产气荚膜梭菌病基因工程疫苗的研制提供了重要的实验数据。     

不同钝化剂对水稻Cd吸收的影响

通过田间试验,研究生石灰(3.00、3.75 t·hm^-2)、海泡石(12.00 t·hm^-2)及石灰-海泡石复合(6.00 t·hm^-2)4个钝化剂处理对低积累早稻品种Cd吸收的影响。研究表明,不同钝化剂处理与对照相比籽粒中Cd的含量均显著降低,降幅在60.0%~72.5%,且水稻籽粒中Cd含量均<0.2 mg·kg^-1。其中,海泡石效果最佳,石灰次之。各钝化剂的添加均显著提高了土壤pH值,其中,12.00 t·hm^-2海泡石处理效果最佳,pH增加了1.7;其次为3.75 t·hm^-2生石灰处理,pH增加1.1;6.00 t·hm^-2石灰-海泡石复合钝化剂和3.00 t·hm^-2生石灰处理的土壤pH分别增加0.9和0.7。不同钝化剂处理土壤有效态Cd含量显著降低,降幅在64.9%~93.2%。其中,海泡石处理的土壤有效态Cd的降幅最高,其次为3.75 t·hm^-2生石灰处理,降幅为74.2%。除3.75 t·hm^-2生石灰处理外,其他钝化剂处理对土壤有机质和主要养分含量无明显影响。3.75 t·hm^-2生石灰处理显著降低了土壤碱解氮和有效磷含量,降幅分别为20.7%和21.0%。水稻籽粒中,Cd含量的降低主要是由于钝化剂的施入提高了土壤pH,进而降低了土壤有效态Cd含量。本研究表明,施用生石灰、海泡石等钝化剂能显著降低水稻籽粒中的Cd含量,而原位钝化结合低积累品种的种植是实现受污染耕地安全利用和稻米安全生产的有效措施。     

犬细小病毒BJ06/06株致病模型的初步建立

犬细小病毒在全国乃至世界范围内广泛流行，而现阶段常用的疫苗对新变异毒株的预防效果并不理想。在新型疫苗的研发过程中，亟需建立评价动物免疫效果的流行毒株攻毒标准。通过对比格犬进行犬细小病毒流行毒株的人工感染试验，从临床症状、血液生化和病理变化等对患病犬进行多维度的综合评价。结果显示，患病犬均表现出了典型的体温升高、呕吐、精神沉郁、腹泻、血便等临床症状，白细胞数量显著降低，血浆白蛋白含量降低、碱性磷酸酶和血清磷含量升高，且不同攻毒剂量组间有显著差异。本研究初步建立了犬细小病毒(BJ06/06株)的致病模型，接种方式为每只比格犬灌服5 mL病毒液(10^4.5TCID₅₀/0.1mL),同时左右后肢各肌肉注射1 mL病毒液。本模型为后续犬细小病毒病新型疫苗的研发和免疫效果评价提供了参考依据。     

应用LSDV-ELISA抗体检测试剂盒检测羊痘疫苗免疫牛血清抗体水平

目前国内尚无商品化的牛结节性皮肤病疫苗，对于该病的防控，我国采用羊痘疫苗进行紧急免疫。为了验证牛结节性皮肤病病毒ELISA抗体检测试剂盒对羊痘疫苗免疫血清抗体水平检测的适用性，本研究采用实验室试制的牛结节性皮肤病病毒ELISA抗体检测试剂盒和病毒中和试验对羊痘病毒活疫苗免疫血清、在研牛结节性皮肤病灭活疫苗（山羊痘AV41株）免疫血清进行抗体水平评价。结果显示，对于羊痘活疫苗免疫血清，ELISA方法和病毒中和试验方法对免疫15d抗体阳性率分别为84.4%和75.6%，免疫30d抗体阳性率分别为100%和95.6%，免疫60d抗体阳性率分别为97.8%和91.1%；与病毒中和试验符合率为86.1%。对于牛结节性皮肤病灭活疫苗（山羊痘AV41株）免疫血清，ELISA方法和病毒中和试验方法对一免28d抗体阳性率分别为64%和56%，二免28d抗体阳性率分别为94%和88%，二免42d阳性率均为100%；与病毒中和试验符合率为86.5%。试验证明，实验室试制的牛结节性皮肤病病毒ELISA抗体检测试剂盒与病毒中和试验符合率较高，检测结果较为一致，且本试剂盒敏感性高于病毒中和试验。因此本试剂盒可用于...