Bacillus subtilis Z-3菌株纤溶酶的分离纯化研究

为获取微生物源溶栓药物,从土壤中获得产纤溶酶活性较高的1株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Z-3。从Z-3菌株的发酵液中提取纤溶酶,利用DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和聚丙烯酰凝胶电泳等方法,对纤溶酶进行分离纯化。分离纯化得到1个单一组分(BSFE-1),SDS-PAGE电泳检测为单一条带,BSFE-1表观分子量为48 kDa,等电点为10.5,属丝氨酸蛋白酶类,纤维蛋白平板法检测纤溶酶活性BSFE-1的比活力为4 494.099 U/mg,BSFE-1在4~50℃和pH 4~11之间活性较稳定。     

棉酚降解菌株的分离及对棉饼的脱毒效果

采集保定某地棉籽榨油厂内土样,以棉酚为唯一碳源筛选到具有高效降解棉酚作用的芽孢杆菌菌株M-4.经过一系列生理生化试验,菌体形态、菌落特征的观察以及16S rDNA的序列分析对其进行鉴定,鉴定M-4菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),与相应标准菌株NBRC 13719的16S rDNA序列相似度达100.00％.另外,对M-4菌株以棉籽饼粉为发酵底物进行固态发酵的发酵参数进行优化,结果表明:M-4菌株在以棉籽饼粉为基础料、添加1.0％蔗糖为碳源、培养基料水比1 g∶ 1.0mL、接种量10％、发酵时间60h的条件下进行固体发酵,棉籽饼粉的脱毒效果最好,棉酚降解率高达97.67％以上,脱毒后的棉酚残存量少于10mg/kg,同时蛋白质含量增加了4百分点.     

紫外-微波诱变选育抗菌肽高产菌株及抗菌肽性质分析

以抑制大肠杆菌能力为指标,采用紫外-微波诱变的方法对Tu-569菌株进行选育,并以遗传稳定性试验评价正突变菌株的稳定性,以获得抑菌能力更强、遗传更稳定的高产菌株;通过观察高产菌株的菌落和菌体形态,以生理生化试验和API 50 CH细菌鉴定条综合评测高产菌株生理生化特性,结合16S r DNA序列分析来鉴定高产菌株的种属;通过考察硫酸铵盐析、透析处理、蛋白酶处理、加热处理、缓冲液pH值等对突变菌株胞外产抑菌物质活性的影响,探索抑菌物质的性质。结果表明,于30 cm处紫外照射240 s时,筛选出1株抑菌圈面积增大0.79倍且传代十次遗传稳定的正突变菌株T-4M-5。选取T-4M-5菌株进行微波诱变,当微波炉参数为P50,辐射共60 s和70 s时,筛选出4株抑菌圈显著增大且遗传稳定的正突变菌株,其中T-70-1菌株的活性最高(抑菌圈面积达到363.8 mm2)且遗传稳定性最好,是Tu-569菌株抑菌圈面积的2.74倍。T-70-1菌株具有与Tu-569菌株相同的菌落菌体形态;除不产接触酶、可耐受10%和15%的Na Cl、可利用D-半乳糖和D-塔格糖外,其余生理生化特性与Tu-569菌株相同;结合16S r DNA序列分析鉴定T-70-1菌株为Bacillus velezensis。T-70-1菌株胞外抑菌物质可被70%饱和度的硫酸铵盐析;该抑菌物质相对分子质量在3.5~8.0 k Da之间;抑菌物质分子结构中含有可被胰蛋白酶或胃蛋白酶酶解的肽键;在pH值3.0~9.0范围内均有较高活性;抑菌物质对40~100℃加热处理具有较强耐受性,但121℃处理后完全失活。经紫外-微波诱变获得了一株高产抗菌肽、遗传稳定的T-70-1菌株,其胞外产抗菌肽抑菌活性较强,耐受胃肠道环境,较为耐热,在畜牧养殖业极具应用潜力。     

番茄灰霉病菌颉颃菌株的筛选及功能基因的分析

本研究采用琼脂平板扩散法从土壤中分离筛选得到8株对番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)具有显著抑菌活性的菌株。离体叶片颉颃实验表明,菌株12-34可显著抑制番茄灰霉病病原菌的生长。通过菌体和菌落形态的观察及生理生化性状分析,初步判断8株颉颃菌为芽孢杆菌属(Bacillus)。对菌株12-34的16S rDNA序列分析表明,该菌株与Bacillus velezensis的16S rDNA序列同源性达99.78%;结合菌株12-34的生理生化特征,将其鉴定为Bacillus velezensis。采用生防相关功能基因srfAA、srfAB、bmyB、fenD、bioA和ituC的特异引物,首次从12-34菌株中扩增到相关的基因片段,表明该菌株具有一定的生防应用潜力。     

枯草芽孢杆菌J530菌株的分离鉴定及其对鸡粪的氨减排作用

筛选出具有产脲酶抑制剂功能的芽孢杆菌菌株并验证其对鸡粪便氨减排的效果。采用以硫酸铵为唯一氮源的培养基,从鸡粪便中富集、分离高效利用氨氮的芽孢杆菌。利用尿素酚红培养基平板与尿素培养基摇瓶培养相结合,筛选不能利用尿素生长的菌株。通过比较各菌株发酵液对大豆脲酶的抑制率,获得对大豆脲酶抑制活性最高的菌株。分析该菌株的16SrRNA基因序列,观察其菌落菌体形态,测定其生理生化特征,以鉴定其种属。将该菌株以1.0×10⁷ CFU/g的接种量接入新鲜鸡粪,30℃静置5 d,评价对鸡粪中芽孢杆菌含量、脲酶活性、氨氮、尿素、尿酸含量、pH、氨气释放量的影响。结果表明,筛选到氨氮利用芽孢杆菌菌株共562个,其中氨氮利用率85%以上的菌株218个;初筛得到不产脲酶菌株23个;复筛得到对大豆脲酶活性抑制较强的菌株(抑制率>50%)6个,其中J530菌株抑制率达99.3%。经鉴定菌株J530为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。该菌株5d内可使鸡粪便中芽孢含量增加50.83倍(P<0.01),使鸡粪中脲酶的活性和氨氮含量分别降低83.86%(P<0.01)和44.41%(P<0.01),尿素含量和尿酸含量分别提高28.80%(P<0.05)和1.51%(P>0.05),pH降低1.15(P<0.05),5 d氨气释放量减少67.88%(P<0.01)。筛选得到了产脲酶抑制剂的枯草芽孢杆菌J530菌株,该菌株可显著降低鸡粪便氨排放。     

兰花枯萎病拮抗细菌的筛选与鉴定

为筛选对兰花枯萎病病原菌尖孢镰刀菌具有拮抗作用的芽孢细菌,从各地采集的土样中分离获得的237株芽孢杆菌进行初筛、复筛,最终从衡水饶阳县棉田的土样中筛选出的芽孢杆菌3A3-15,对病原菌有较强的抑菌活性,且抑菌谱广。结合形态学观察、生理生化试验,根据16S rDNA序列相似性分析,此菌株与Bacillus velezensis标准菌株CR-502的16S rDNA序列相似度达99.92%,因此,鉴定拮抗菌株3A3-15为Bacillus velezensis。     

中温α-淀粉酶高产菌株的选育研究

饲料酶制剂为饲料业发展水平的提高提供了条件。我国饲料以玉米为主,玉米中含有大量淀粉,通过α-淀粉酶的协调作用,使淀粉预降解,既达到了切断长链淀粉的作用,又减少了黏度,加快了饲料的催化,从而提高了饲料的转化效率,为此α-淀粉酶在饲料酶中占据着很重要的地位。为提高α-淀     

1株鸡肠源益生芽孢杆菌的分离·鉴定及其耐受特性研究

从人工饲养的健康仔鸡的盲肠和大肠中分离出1株对大肠杆菌有较强拮抗作用的芽孢杆菌菌株Y-1,对该菌株进行了菌落形态、培养特征观察和生理生化特性鉴定及16S rDNA序列的分析。以16S rDNA序列为基础构建了包括11株相关种属细菌在内的系统发育树,其中与11个芽孢杆菌属的菌株的16S rDNA序列的同源性为94.63%~99.35%,Y-1被鉴定为侧孢短芽孢杆菌。模拟体内高胆盐环境(胆盐含量0.3%),监测菌株的耐受能力,然后测定在人工胃液、肠液环境中作用不同时间后的存活菌数。试验结果表明,Y-1在胆酸盐、人工胃液、人工肠液中表现出了很强的耐受能力。     

一株棉花黄萎病拮抗芽孢细菌的分离鉴定及活性检测

 采用改良的琼脂平板扩散法,通过初筛和复筛,得到一株对棉花黄萎病病原菌大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）具有较强的抑菌活性的拮抗细菌Z-5菌株。通过对该菌株的形态特征观察、生理生化鉴定和16S rDNA的序列分析,确定拮抗细菌Z-5菌株为Bacillus malacitensis。盆栽实验表明Z-5菌株对大丽轮枝菌的防治效果达到76.05%,对棉花黄萎病具有明显的防治作用。     

耐酸产蛋白酶芽孢杆菌SD48菌株液体发酵豆粕产大豆肽条件的优化

为了确定甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)SD48菌株液体发酵豆粕产大豆肽的最优培养基组成和最佳发酵条件,以大豆肽含量为指标,通过单因素试验确定最优碳源种类、无机盐种类和发酵温度;通过正交试验确定最适碳源、豆粕、硫酸铵和无机盐的含量,以及SD48菌株接种量、起始pH值、装瓶量和发酵时间。结果表明,最优培养基组成:可溶性淀粉含量为1.00%,豆粕含量为15.00%,硫酸铵含量为4.00%,硫酸锰含量为0.09%;最适发酵条件:起始pH值为6.00,装瓶量为40%,SD48菌株的接种量为6.00%,发酵温度为28℃,培养时间为72 h。由此获得的大豆肽含量为8.03%,相对含量为71.06%,抗氧化活性达到343.70μg AEAC/mL。综上,获得了SD48菌株液体发酵豆粕产大豆肽的最佳条件,提高了大豆肽的产量。