甘蓝自交不亲和相关基因BoPUB9的克隆及表达分析

自交不亲和性(self-incompatibility,SI)是指植株的雌蕊对自身花粉和异体花粉进行识别从而抑制自身花粉萌发的特性, PUB (Plant U-Box)蛋白在植物抗逆及信号转导过程中起着重要的作用。本研究通过分析甘蓝自花授粉0～60min的柱头转录组数据,筛选到1个受自花授粉诱导上调表达的PUB蛋白编码基因BoPUB9。BoPUB9 cDNA序列长度为1368 bp, gDNA序列全长1720 bp,含有1个臂重复结构域和1个U-box结构域。荧光定量PCR结果显示, BoPUB9基因在甘蓝的不同组织中均有表达,在萼片中的表达量最高,花瓣、雄蕊、柱头表达量次之,在花粉花蕾中表达量相对较低,同GUS染色结果保持一致。BoPUB9基因在自花授粉0～30 min内快速上调表达, 15 min后为异花授粉后表达量的20多倍,在30min后达到差异最大,自花授粉后的表达量为异花授粉的40多倍。亚细胞定位结果显示,BoPUB9蛋白在细胞核和细胞质中均有表达,且BoPUB9蛋白在大肠杆菌中被成功诱导表达,相对分子质量为51 kD,与预测结果一致。酵母双杂交与poll-down结果显示...     

大豆耐热β-淀粉酶基因在大肠杆菌中的表达

以含耐热β-淀粉酶的大豆品种中黄20为材料,从未成熟大豆子叶组织中提取总RNA,利用RT—PCR扩增出预计大小的cDNA片段。将该片段克隆至pGEM—T载体,经酶切分析和测序,克隆的β-淀粉酶的基因的cDNA片段长1491bp,与已报道序列只存在个别的碱基差异,同源性达到99％,编码497个氨基酸残基的多肽,预计相对分子质量56KD。酶切片段与经相同酶酶切的表达载体pET-43．1（a）连接,转入大肠杆菌中,并使其高效表达。SDS—PAGE表明,大肠杆菌表达的大豆β-淀粉酶的相对分子质量约为50KD。     

甘蓝SCR识别与结合SRK胞外域核心编码区DNA序列的酵母双杂交检测

SCR是芸薹属自交不亲和性的雄性决定因子。为研究SCR与SRK之间相互作用的核心区段,通过构建结球甘蓝的包含系列不同长度的SCR的cDNA序列的pGBKT7融合载体,利用酵母双杂交系统检测SCR与SRK之间的相互作用。结果显示,构建的载体均未出现自激活现象,所获得SCR全长与其相对应SRK胞外域具有相互作用,且相互作用核心编码区位于SCR编码基因的第97~186 bp处。实验结果还显示,此单倍型的SCR信号肽剪切位点及相邻的几个氨基酸残基对相互作用实验结果有干扰作用。以上结论为包括甘蓝在内的芸薹属自交不亲和机制的研究提供了新的实验依据。     

生物化学实验内容改良及探讨

对生物化学实验课实验项目设置的依据、生物化学实验理论教学的增加、实验材料的专业选择以及传统经典方法和生物化学实验新技术、生物化学实验与科学研究相结合的生物化学实验改良的内容进行了探讨与分析。     

甘蓝MLPK基因的克隆与序列分析

采用PCR、RT-PCR以及其他分子生物学方法，以甘蓝基因组DNA和柱头cDNA为模板对MLPK基因进行扩增克隆，首次得到长度分别为1 615 bp和1 294 bp的基因片段。序列分析表明，甘蓝MLPK与芜菁MLPK的cDNA序列相似性达98%，前者的内含子数为4个，比后者少了3个；同时，在前者内含子中发现了不同于典型的GU-AG规则的新的序列，即第3、4个内含子5′端碱基是TA、CG，3′端碱基为CAGG、GT，推测甘蓝MLPK的mRNA具有独特的剪切机制。这为甘蓝自交不亲和分子机理研究提供了新内容。     

金钗石斛对磷素的吸收和运转

应用32 P研究了金钗石斛对磷素的吸收和运转。结果表明 ,金钗石斛植株各部位均可吸收磷素 ,成长叶的总放射性活度最高。植株吸收的总32 P放射性活度随根系吸收时间的延长而增加 ,至 96h达最高 ;随移栽后日龄的增加 ,植株各部位干物重逐渐增加 ,新生茎和新生叶增加最快 ,32 P亦逐渐向新生茎和新生叶运转。 2 5℃和 40℃温度处理 ,植株吸磷量分别为 1 0℃处理的 2 3和 2 5倍。中度光 ( 2× 1 0 4 Lx)和高光强( 5× 1 0 4 Lx)下植株吸磷量分别较弱光 ( 5× 1 0 3Lx)下增加 74%和 2 3 %。     

甘蓝和油菜中类硫氧还蛋白THL2基因的克隆与序列分析

 采用PCR和RT-PCR方法，对甘蓝和油菜的基因组DNA和柱头总RNA进行扩增，获得了类硫氧还蛋白THL2的DNA和cDNA。序列分析首次表明THL2基因有两个内含子，并且在油菜和甘蓝中的大小不同。进一步分析表明，油菜和甘蓝中THL2 DNA序列的同源性为96％。     

温度胁迫对甘蓝蛋白质磷酸化的影响

用SDS-PAGE放射自显影技术以及液闪测定技术研究了2种温度胁迫条件下甘蓝体外蛋白激酶活性变化及其对Ca^2 的依赖情况,并进行了温度胁迫磷酸化蛋白的分离。结果表明：甘蓝受到高温(35℃)或低温(5℃)胁迫时,体内蛋白激酶活性在3min内迅速升高,随着温度胁迫时间的进一步延长而迅速降低,发现温度胁迫下,蛋白激酶对Ca^2 具有明显的依赖性。从放射自显影结果来看,2种温度胁迫都会发生分子量为22．9kD的特异蛋白质体外磷酸化;在逆境温度处理10min内,磷酸化蛋白质含量较高,随着低温处理时间的延长,磷酸化蛋白质含量迅速下降。     

甘蓝SRK的S域及SCR酵母表达载体的构建及其相互作用区段的研究

 为了深入研究S位点受体激酶（SRK）和S位点富含半胱氨酸蛋白（SCR）甘蓝自交不亲和（self-incompatibility,SI）信号传导的雌雄决定因子的相互作用机制,以自交不亲和性高的结球甘蓝为材料,采用酵母双杂交体系,构建pGADT7-eSRKs和pGBKT7-SCRs重组载体,并分别转化到Y187和Y2HGold酵母中,通过SD/-Ade-His-Trp-Leu平板上菌落的形成,PCR以及x-α-gal显色反应鉴定转化到酵母中的两个重组质粒相互作用。结果表明,SRK S域的SRK1及SRK4分别与SCR2相互作用,且初步显示其相互作用区域为SRK第1个外显子的第16 ~ 421 bp的片段和SCR第1 876 ~ 2 068 bp的片段。这既为SRK-SCR相互作用提供了具体证据,也为甘蓝自交不亲和性分子机理的深入研究提供了新内容。     

大豆耐热β-淀粉酶基因在大肠杆菌中的表达

以含耐热β-淀粉酶的大豆品种中黄20为材料,从未成熟大豆子叶组织中提取总RNA,利用RT-PCR扩增出预计大小的cDNA片段.将该片段克隆至pGEM-T载体,经酶切分析和测序,克隆的β-淀粉酶的基因的cDNA片段长1 491 bp,与已报道序列只存在个别的碱基差异,同源性达到99%,编码497个氨基酸残基的多肽,预计相对分子质量56 KD.酶切片段与经相同酶酶切的表达载体pET-43.1(a)连接,转入大肠杆菌中,并使其高效表达.SDS-PAGE表明,大肠杆菌表达的大豆β-淀粉酶的相对分子质量约为50 KD.