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小鼠乳清酸蛋白上游调控序列的克隆及其指导下CAT基因在家兔乳腺中的表达 总被引:1,自引:0,他引:1
应用PCR技术,从小鼠基因组中克隆了1.6kb乳清酸蛋白(WAP)基因5′上游调控序列,经酶切和测序证实与已知序列基本一致.为了证实此调控序列能否指导外源基因在乳腺中的表达,将此序列与报告基因CAT融合,构建了pWAP-CAT-polyA乳腺定位表达载体,脂质体包裹后,经乳导管将其注入到妊娠中后期家兔乳腺中进行暂时表达.分别于家兔分娩后1~10 d采奶,用ELISA检测乳汁中CAT含量.结果表明,所构建的载体在家兔乳腺中能够表达,表达水平在家免分娩后1~5 d较高. 相似文献
23.
感染性犬2型腺病毒全基因组克隆及鉴定 总被引:13,自引:1,他引:12
以犬 2型腺病毒 (canine adenovirus type- 2 ,CAV- 2 )自然弱毒株 YCA18基因组 DNA为模板 ,经 PCR扩增分别获得其双链两末端 10 13bp(U)和 972 bp(D)的 DNA序列 ,以首尾相接方式克隆入载体 p Poly2 ,获得重组质粒p Poly2 - UD。以 Hind 和 Bst B 双酶切 p Poly2 - UD,回收含载体和部分 U、D的大片段并与 CAV- 2 DNA共转化感受态 E.coli Sure TM,经菌体内同源重组 ,获得含有 CAV- 2全基因组序列的重组质粒 p Poly2 - CAV- 2。后者以 Cla 和 Asc 双酶切 ,释放 CAV- 2全基因组 ,通过脂质体介导转染 MDCK细胞 ,盲传 3代后重复转染 1次 ,4d后 ,出现腺病毒典型病变。细胞上清血凝效价为 1∶ 6 40 ,并可被 CAV- 2抗血清有效抑制。以上结果表明 ,本研究获得了具有感染性的CAV- 2全基因组重组质粒 ,为以 CAV- 2作为重组疫苗载体的系列研究奠定了重要基础。 相似文献
24.
为了探究狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)基因间隔区对狂犬病病毒生物学特性的影响,试验以狂犬病病毒CVS-11株为母本株,将其基因间隔区碱基均替换为胞嘧啶和胸腺嘧啶,分段扩增后与真核表达载体进行同源重组,运用反向遗传技术进行重组病毒拯救,经过菌液PCR鉴定和直接免疫荧光检测获得重组病毒rCVS11-2222。结果表明:重组病毒基因组稳定,重组病毒rCVS11-2222在细胞中的复制表现出与CVS-11株相似的特点;小鼠存活率显著降低。说明狂犬病病毒CVS-11株基因间隔区的缩短增强了原毒株的致病力。 相似文献
25.
伪狂犬病病毒TKˉ/gIˉ株基因组经AscⅠ酶切获得含PK基因的8.7kb片段,将此片段克隆入pPolyⅡ载体的AscⅠ位点,获得中间载体P8-AA,将LacZ表达盒插入其SphⅠ/NdeⅠ位点,构建重组转移载体P8AA-lacZ,将其与伪狂犬病病毒TKˉ/gIˉ株基因组共转染PK-15细胞,细胞出现病变后通过覆盖含有X-gal的营养琼脂进行蓝白斑筛选,通过蚀斑克隆方法分离到重组体PRV(rPRV),且经过连续传代的rPRV仍能稳定的表达β-半乳糖苷酶活性。通过对重组病毒PRV-LacZ和亲本株TKˉ/gIˉ株TCID50的试验表明,PK基因的缺失对病毒增殖无影响。 相似文献
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28.
由牛 β-酪蛋白 ( β-Casein)启动子与大鼠乳清酸蛋白 ( WAP)启动子融合及串联构建成 2个组织纤溶酶原激活剂 ( t-PA) c DNA乳腺定位表达载体 p SVL-βΔWAP-PA和 p SVL-WAPβ-PA。将这 2种表达质粒分别注入怀孕家兔乳腺导管中 ,溶圈试验结果显示 ,2种质粒均能在家兔乳腺中表达 ,且以分娩后第 5天的乳汁中表达水平最高 ,分别为 70 0 μg/ L和 50 0 μg/ L。本试验为进一步研究 t-PA基因乳腺定位表达调控和建立 t-PA乳腺生物反应器奠定了基础 相似文献
29.
一种简便快速的体外点突变方法 总被引:1,自引:0,他引:1
体外点突变是研究蛋白质结构 -功能关系、基因表达、载体修饰等的重要技术之一。已报道的一些体外突变方法 [1~ 4 ] ,一般需以单链 DNA为模板 ,并要求对突变基因进行亚克隆和对单链 DNA拯救 ,技术上较复杂 ,多数需 1周以上时间。Stratagen公司研制的 Quickchange试剂盒 ,可以双链 DNA质粒为模板 ,只需 4步操作 ,在 1~ 2 d内即可完成点突变过程 [5] ,但该试剂盒价格昂贵 ,使用次数有限。我们根据 Pfu和 Dpn 等酶的特性 ,自行设计了突变反应及方法 ,对 6kb、8kb和1 4.6kb的目的质粒分别进行了点突变 ,成功地在质粒上创造了相应的酶切… 相似文献
30.
犬细小病毒分离鉴定及其基因型调查的基础研究 总被引:5,自引:0,他引:5
用F81细胞从不同地区送检的25份肠炎犬病料中分离出10株细小病毒,经形态学,理化学,生物学和分子病毒学等鉴定,结果这10株病毒均能在F81细胞上生长,产生细胞肿胀、变圆、破碎、脱落等细胞病变;病毒粒子呈立体对称,直径为20~24nm,无囊膜,抗氯仿,耐酸,耐热,能被5-IUDR抑制,可凝集猪、马、猫的红细胞,不能凝集人、鸡、豚鼠、兔的红细胞,HA试验能被抗CPV的特异性抗体所抑制,用犬细小病毒(CPV)特异性引物对10株病毒进行PCR扩增,结果扩增片段与阳性对照大小一致(771bp),用PV/犬/JL/1/02、PV/犬/BJ/1/99和PV/犬/GZ/1/02三个毒株进行人工感染犬试验,结果人工感染犬在接种后白细胞总数出现短期不同程度的下降,在攻毒后4~14d粪便PCR检查阳性,其中接种PV/犬/BJ/1/99的一只犬出现严重的肠炎症状并死亡,其余接种犬没有出现明显的临床症状,但血清抗体均升高(大于5倍),而对照组的白细胞总数和血清抗体没有明显的变化,粪便PCR检测阴性,表明所分离毒株能够感染犬,鉴定结果证明,CPV在我国犬群中仍广泛存在。 相似文献