龙眼胚性愈伤组织AGO10基因克隆及其表达分析

【目的】探究龙眼胚性愈伤组织Argonaute10(AGO10)基因的特性与龙眼生长发育、激素响应及非生物胁迫响应之间的关系。【方法】根据龙眼胚性愈伤组织转录组数据库Unigene序列,采用RT-PCR结合RACE技术,以‘红核子’龙眼胚性愈伤组织cDNA为模板,进行龙眼胚性愈伤组织DlAGO10基因的克隆和生物信息学分析,同时利用qRTPCR技术分析DlAGO10基因在龙眼体胚发生过程中、不同组织部位中、对不同激素的响应以及非生物胁迫响应的表达情况。【结果】获得龙眼DlAGO10基因的c DNA全长序列(GeneBank登录号为MH708535),全长共3 859 bp,其中包含完整开放阅读框(ORF)3 003 bp,编码999个氨基酸。生物信息学分析表明,DlAGO10的保守结构域具有AGO的经典结构域PiWi结构,与甜橙和克莱门柚AGO10蛋白同源性较高。qPCR分析结果表明,在龙眼体胚发生过程中,DlAGO10在龙眼非胚性愈伤组织时期和子叶胚时期的表达量较高,在‘红核子’龙眼合子胚S5阶段的相对表达量最高;不同组织部位的表达情况为,DlAGO10在‘红核子’龙眼雌花中表达量最高,雄花次之,其他组织部位表达量均较低。植物激素和非生物胁迫处理下的表达分析表明,一定浓度的2,4-D、KT和水杨酸(SA)均可诱导DlAGO10上调表达,而茉莉酸甲酯(MeJA)即可上调也可下调;盐、渗透、干旱和脱落酸(ABA)胁迫均可上调DlAGO10的表达。【结论】DlAGO10可能参与龙眼体胚发生早期和晚期的转录调控过程,且可能参与生长素、细胞分裂素、SA和ABA的逆境胁迫信号转导途径,调控龙眼多种非生物胁迫应答过程。     

相思树悬浮细胞培养及其细胞形态学观察

试验分析了基因型、愈伤组织类型、2,4-D 浓度、蔗糖浓度,起始接种量等各因素对相思树悬浮细胞培养的影响。结果表明：选择淡黄色,质地鲜嫩松脆的愈伤组织作为相思树悬浮培养的材料,能较快地建立起悬浮细胞系。黑木相思细胞小,胚性强,分散性好,最容易建立起悬浮细胞系。当蔗糖浓度为 30 g/L,2,4-D 浓度为 0.5 mg/L时,适宜于悬浮细胞的保持。起始接种量对相思悬浮细胞系生长也有很大影响,从保持悬浮细胞系的角度看,每瓶 25 mL 培养基中适宜的接种量为 0.5~1.0 g。台湾相思悬浮细胞培养周期以 7 d 继代 1 次,卷荚相思悬浮细胞培养周期以 8~10 d 为宜。同时,通过对悬浮细胞培养的显微观察可以看出不同基因型的相思树悬浮细胞,其细胞生长状态各不相同。     

三明野生黄精无菌体系的建立

通过优化消毒和不定芽诱导条件等,建立了三明野生黄精根状茎的组培体系。结果表明：将野生黄精外植体依次在清水下用软毛刷刷洗去野生黄精根状茎表面的泥土,在加洗衣粉的自来水中冲洗16 h,在3%多菌灵浸泡2 d（期间时常振荡摇晃）,用清水洗去表面残留的多菌灵后置于滤纸上晾放5 h,再用75%酒精处理30 s,加0.2%氯化汞浸泡15 min消毒处理之后,野生黄精外植体的污染率低至20.2%。春季3—4月的野生黄精外植体的不定芽萌发能力和长势均明显优于11—12月。三明野生黄精的最佳不定芽诱导培养基为：MS+6-BA 4.0 mg/L +NAA 0.2 mg/L,在其上培养时诱导出芽率高达88.0%。     

热胁迫下水仙花叶片的转录组分析

为研究水仙响应高温胁迫过程中相关基因的表达及响应热应激的分子机制,本研究以漳州水仙花为材料,使用BGISEQ-500测序技术,对高温（30、35 ℃）处理及正常生长条件（15 ℃）的水仙叶片进行转录组学的测序分析。使用Trinity软件对15（对照）、30、35 ℃（高温胁迫）处理24 h的水仙叶片测序数据进行从头组装,利用BLAST软件进行基因比对注释,通过DEGseq和PossionDis检测差异表达基因,并对差异表达基因进行GO和KEGG富集分析。结果表明：本次水仙花叶片测序共获得112 160条总长度为128 733 815 bp、平均长度为1147 bp的Unigene,其N50以及GC含量分别为1770 bp和42.33%。Nr比对注释匹配度最高的物种为石刁柏,利用KOG数据库进行比对,5560条Unigene序列分布于25个功能区域。差异表达基因GO富集显示与光合系统及膜系统相关的GO term被显著富集,KEGG分析显示次生代谢物的生物合成、苯丙烷类生物合成、代谢途径、光合作用、糖胺聚糖降解、乙醛酸和二羧酸代谢、光合作用-天线蛋白、单萜类生物合成等8条代谢途径在3个比较组中均显著性富集,硫胺素代谢途径是唯一在高温胁迫条件下均显著富集的代谢途径。本研究注释了大量相关基因序列,通过本研究为改善水仙花植物的耐热性及耐热性品种的培育提供了丰富的数据资源和分子基础。     

龙眼HD-Zip基因家族生物信息及表达分析

为了解龙眼HD-Zip基因家族的功能,本研究基于龙眼基因组与转录组数据库,对提取的19个龙眼HD-Zip家族成员的启动子、可变剪接以及受到调控的miRNA种类进行分析;并采用实时荧光定量PCR技术,分析了在ABA处理下龙眼胚性愈伤组织（embryonic callus,EC）中HD-Zip部分成员的表达模式,以及HD-Zip部分成员在不同体胚阶段的表达模式。结果表明：龙眼HD-Zip家族除含有TATA-box和CAAT-box以外还含有大量的光响应元件、激素响应元件以及胁迫响应元件,暗示龙眼HD-Zip家族成员可能参与光反应、激素响应以及非生物胁迫的过程;龙眼HD-Zip在不同组织部位与不同体胚阶段的可变剪接方式主要以内含子保留为主;龙眼HD-Zip基因家族成员主要受到miRNA166a的调控;在外源激素ABA处理下龙眼EC中HD-Zip家族部分成员的表达模式以及部分成员在不同体胚阶段的表达模式都呈现多样化,推测龙眼HD-Zip参与龙眼不同体胚发育的调控,并且可能通过调节内源ABA的浓度进而影响胚性愈伤组织的生长发育以及形态的建成。     

光质对龙眼胚性愈伤组织柯里拉京含量的影响

通过超声波提取‘红核子'龙眼胚性愈伤组织中的柯里拉京[β-1-O-galloyl-3,6-(R)-hexahydroxydiphenoyl-D-glucose],并优化色谱分离条件,采用超高效液相色谱法(ultra performance liquid chromatography,UPLC)测定其含量,探讨培养天数及光质对龙眼胚性愈伤组织柯里拉京含量的影响。结果表明,龙眼胚性愈伤组织黑暗培养25 d柯里拉京含量最高;不同光质处理下柯里拉京含量依次为:黑暗(18.81 mg·g-1)红光(16.99 mg·g-1)绿光(16.89 mg·g-1)白光(15.10 mg·g-1)蓝光(12.52 mg·g-1),黑暗条件最有利于其合成,而蓝光则抑制其合成。     

龙眼体胚发生早期4CL基因家族鉴定与功能分析

为了解龙眼4-香豆酸：辅酶A连接酶（Dl4CL）基因家族的分子特性及生物学功能。采用生物信息学分析方法进行龙眼4CL基因家族的成员鉴定,蛋白结构域及特性、分子进化树、体胚发生过程和组织器官中的表达规律分析以及可能互作的miRNA预测。结果显示,Dl4CL基因家族包含43个成员,分为6个亚家族;不同亚家族成员的基本理化性质包括等电点、相对分子量、氨基酸个数及信号肽有所差别;Dl4CL蛋白均属于非分泌型蛋白,具有多个保守的motif;各成员基因结构特性与进化树中家族成员亲缘关系的远近有关;Dl4CL启动子序列包含大量光响应元件、厌氧诱导响应元件及MYB结合位点,推测Dl4CL家族成员可能参与龙眼生长发育过程中黄酮类物种的生物合成以及色素的积累;Dl4CL可能参与不同胚胎发育过程和不同组织器官的形态建成;43个Dl4CL成员共有10个受miRNA调控,并且不同成员受不同的miRNA靶向调控,推测Dl4CL可能通过与miRNA互作参与体胚发生、响应环境胁迫等过程。研究表明,Dl4CL在龙眼体胚发生早期除了参与木质素的合成之外,还可能参与色素合成、组织器官特异表达等多种生物代谢途径,表现其生物学功能的复杂性。     

HPLC 法测定LED 不同光质下迷迭香 愈伤组织中鼠尾草酸含量

以迷迭香(Rosmarinus officinalisL.)愈伤组织为材料,采用高效液相色谱法(HPLC)测定了不同LED光质下迷迭香愈伤组织中鼠尾草酸的含量.HPLC法测定鼠尾草酸的色谱条件为:C18色谱柱,柱温30℃;流动相为乙腈∶0.1％磷酸=55∶45 (V/V),流速1.5 ml/min,紫外检测波长210 nm,等度洗脱,时间30 min.结果表明:与黑暗和日光灯白光下的愈伤组织对照,LED黄光下愈伤组织生长最好,LED白光下生长较好,LED蓝光下生长最差;不同LED光质下迷迭香愈伤组织中鼠尾草酸含量从高到低依次为:LED白光＞日光灯白光＞ LED蓝光＞LED红光＞LED绿光＞LED黄光;LED白光下迷迭香愈伤组织鼠尾草酸含量最高,同时较利于愈伤组织生长.     

玉米单倍体核磁共振自动分拣系统的开发

摘要：为满足玉米单倍体育种与研究的大规模应用,本研究利用玉米油份花粉直感效应的生物学特性,开发了玉米孤雌生殖诱导单倍体核磁共振自动识别分拣系统。该系统由单籽粒自动进样模块、玉米油份自动测试模块和自动分拣模块三大模块组成。结果证实该玉米单倍体核磁共振自动分拣系统具有快速（平均速度为4秒/粒）、准确（平均为92.3%）、自动、智能分拣玉米单倍体的优良特性,同时,本系统也可应用于基于油份差异的其他样品的自动智能化筛选。     

龙眼miR408与DlLAC12克隆及其在球形胚发生和非生物胁迫下的表达分析

为探讨mi R408及靶基因DlLAC12在龙眼球形体细胞胚诱导及不同非生物胁迫下的表达模式,采用miR-RACE PCR和Tail-PCR克隆获得pri-miR408 cDNA和转录起始位点、dlo-miR408 gDNA、靶基因DlLAC12 cDNA及启动子pro-MIR408序列。研究结果显示：dlo-pri-miR408 cDNA、gDNA全长均为706 bp,5′端转录起始位点为胞嘧啶（C）。DlLAC12 cDNA全长为1 725 bp,pro-MIR408全长为1 532bp。pro-MIR408序列上存在ABA、GA3、JA等激素信号传导顺式作用元件和响应光、低温胁迫等相关元件。q RT-PCR结果显示,dlo-miR408-3p随外源添加的蔗糖浓度、Cu2+浓度及培养温度的变化呈现动态表达;而dlo-miR408-5p1对蔗糖不敏感,在铜离子失衡和低温时下调表达。dlo-miR408-3p与DlLAC12负调控模式能响应高浓度ABA（≥500μmol·L-1）处理,而不同浓度GA3处理下二者表达模式一致。dlo-miR408-3p与DlLAC12在球形胚诱导不同天数...