分子连锁分析探讨家蚕高抗BmNPV品系的抗性遗传基础

【目的】家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)所引发的血液型脓病是一种传染性强的蚕病,极大地影响蚕业生产。本研究旨在定位对BmNPV高抗的家蚕品系中控制其抗性的基因,进而解析其抗性遗传机制,为培育抗性素材和品系提供理论支持。【方法】以BmNPV高抗家蚕品系99R和较感品系Dazao-N为亲本,配制连锁分析(BC_1F)和定位分析(BC_1M)回交群体。首先对两个亲本品系进行浓度梯度添毒,统计感病死亡的家蚕头数,运用SPSS 17.0软件,计算其半致死剂量(LD_(50)),在此基础上确定BC_1分离群体的攻毒剂量,并通过单头定量攻毒,选取感病个体作为连锁定位分析材料;利用筛选得到的覆盖家蚕全套常染色体的多态性标记进行分型,并通过T检验计算各标记与抗性的连锁显著性水平(P值),筛选出与抗性相连锁的标记。在这些标记所在的染色体上加密标记,检测各标记在定位分析群体中的基因型,定位抗性基因。【结果】LD_(50)(99R)=2.92×10~6个多角体/头,LD_(50)(Dazao-N)=9.78×10~5个多角体/头,基于双亲的半致死剂量,选择介于两者之间且略高于其均值的剂量——2×10~6个多角体/头作为BC_1分离群体的攻毒剂量;先后于2014年秋季和2015年春季处理并检测连锁分析群体,前后两次所进行的连锁分析结果有较大差异,其中第一次找到Chr22上的多态性标记S2205与99R抗性连锁,而第二次的连锁分析显示标记S2205与抗性不连锁,也没有找到其他的连锁关系。通过与前人对BmNPV抗性的连锁定位分析结果进行对比,发现连锁定位分析结果的不可重复性是一个普遍的问题。AY380833是GenBank中已公布的在家蚕高抗品系NB和871C中与其抗性位点紧密连锁的分子标记,本研究调查发现其与99R和871C的抗性位点均不连锁。【结论】分子连锁分析结果证明,家蚕对BmNPV的抗性在不同抗性品系中遗传基础有很大的差异性,同一品系可能具有多个抗性位点;家蚕对BmNPV的抗性是一种复杂性状,在符合"质量-数量性状"结论的同时,其数量性状特征突出。     

家蚕品种资源对微粒子病的抗性调查

基于查明家蚕品种资源对微粒子病的抗性水平 ,为微粒子病抗病品种的选育提供素材和理论依据 ,对 138个保存的中系、日系、欧洲系统和多化性系统家蚕品种进行微粒子病抗性测试。试验结果表明 :用ID50 指数表示品种抗性水平的高低 ,ID50 指数最高的品种为最低品种的 18.9倍 ,大多数品种间的ID50 指数较为接近 ;经抗性差异显著性检验 (Q测验 ) ,品种之间抗性水平存在显著差异 ,少数品种之间差异达极显著水平 ,多数为抗性一般品种 ,少数是抗性较强或敏感品种 ,不同系统表现抗性水平有所差异的趋势     

利用SSR标记对家蚕耐氟基因进行连锁定位分析

采用家蚕耐氟品系T6和敏感品系733新组配正反交群体(733新×T6)×733新和733新×(733新×T6),分别记作BC1F和BC1M。基于雌性家蚕染色体不发生交换,用已构建的家蚕SSR连锁图上的标记对耐氟基因(dominant endurangce to fluoride,Def)进行了定位及连锁分析。在28个连锁群上都找到了多态标记,其中只有3个位于12连锁群上的SSR标记与耐氟基因连锁。根据第12连锁群上已有的微卫星序列,寻找其所在的Scaffold上的其它SSR位点,并设计引物,找到一个新的多态性SSR标记。BC1F群中的所有耐氟个体均表现出与(733新×T6)F1相同的杂合型带型,而所有敏感个体带型与亲本733新一致,均为纯合型,说明家蚕耐氟性状是由位于第12连锁群上单个显性主效基因控制的。利用另一个群体BCM构建了耐氟基因的遗传连锁图。     

对家蚕第2隐性赤蚁基因(ch-2)的SSR标记定位及连锁分析

家蚕蚁蚕体色突变之一的第2隐性赤蚁(ch-2)有作为特殊遗传系统的实用价值。采用家蚕正常黑蚁品种P50和第2隐性赤蚁品种k04为亲本组配正反交群体,回交后获得回交群体(k04×P50)×k04和k04×(k04×P50),分别记作BC1F和BC1M,基于雌性家蚕的W与Z染色体不发生交换的特点,用已构建的家蚕SSR分子标记连锁图谱对ch-2基因进行定位和连锁分析。在第18连锁群上的20个多态性标记中共筛选出7个与ch-2基因连锁的SSR标记。根据第18连锁群上已有但不表现多态性的微卫星序列,寻找其所在Scaffold上的其他SSR位点并设计引物,结果找到2个新的多态性SSR标记。BC1F群体中的所有黑蚁个体均表现出与F1(k04×P50)相同的杂合型带型,而所有赤蚁个体带型与亲本k04一致,为纯合型,说明家蚕ch-2基因位于第18连锁群。利用另一个群体BC1M构建了ch-2基因的SSR分子标记遗传连锁图,连锁图的遗传距离为70.7cM,ch-2基因位于69.6 cM处。2个与ch-2最近的SSR标记为S1814和S1819,与ch-2的距离分别为7.9、1.1 cM。     

家蚕广食性系统C01对不含桑叶粉人工饲料摄食性的遗传

C01是用不含桑叶粉的人工饲料作检测物,从家蚕种质资源中国系统中筛选得到的摄食性优良的品种。用对不含桑叶粉的人工饲料无摄食性的中国系统1015与C01杂交,对F1、F2和BC1世代蚁蚕用不含桑叶粉的人工饲料检测,分析C01对不含桑叶粉的人工饲料摄食性的遗传规律。结果表明:C01对不含桑叶粉的人工饲料摄食性为隐性遗传,并且由常染色体基因支配。卡平方(X2,chi-square)测定结果显示,广食性品种C01对不含桑叶粉人工饲料摄食性遗传除了受1个隐性主基因控制外,同时还有修饰基因的作用。     

蚕种质资源共享平台信息系统设计

应用ASP(active server page)技术,通过Access数据库设计和构建了蚕种质资源共享平台信息系统,网址为http://www.cnsilkworm.com/。介绍了蚕种质资源信息共享系统是集成数据库技术和网络技术构建的基于B/S结构的动物种质资源数据标准化管理和共享发布的平台,系统中建立了家蚕、柞蚕和蓖麻蚕等动物的数据库,数字化了800多份种质的信息。并指出信息系统主要包括蚕种质资源数据管理、数据检索、共享信息发布等功能模块,实现了蚕种质资源数据库共建、信息共享。     

基于家蚕中肠RNA-seq数据的新基因发掘及初步分析

对前期获得的家蚕中肠组织转录组数据进行进一步生物信息学分析,利用Cufflinks软件对Mapped Reads进行组装,并与参考基因组注释信息进行比对,共发掘新基因788个。利用Blast软件将发掘的新基因与NR,Swiss-Prot数据库比对,其中746个新基因得到功能注释。这些新发掘基因在家蚕28个连锁群上都有分布,其中在第15连锁群上最多。有198个新基因注释到KEGG数据库中,分布于85条已知的通路中,将新基因与COG数据进行比对,并进行功能注释与分类,总共有258个新基因得到了注释,被分为22个COG类别,部分新基因的克隆分析,与预期结果一致,这些发现为以后进一步研究新基因的功能提供了基础信息。     

家蚕胰脂肪酶相关蛋白1基因(BmPLRP1)的克隆及表达分析

胰脂肪酶相关蛋白1(Pancreatic lipase-related protein 1, PLRP1)是由PLRP1基因编码的一种脂肪酶,在通常状态下无活性。PLRP1的分泌与生物的生长发育有着密切的联系,但该基因在家蚕中的功能尚未清楚。本研究克隆获得家蚕PLRP1基因(BmPLRP1)的核苷酸序列,并对其序列特征进行生物信息学分析,进一步采用半定量RT-PCR和荧光定量PCR检测BmPLRP1基因的表达水平。结果表明,该基因位于家蚕第12号染色体的nscaf2993位点,编码331个氨基酸,等电点为8.72,预测的BmPLRP1蛋白无信号肽、分子质量为37.1 kD,没有跨膜结构域,具有一个Pancreat_lipase_like结构域,存在活性位点、磷酸化位点、O-糖基化位点,不存在N-糖基化位点。系统进化分析表明BmPLRP1与野桑蚕的PLRP1的进化关系较近;RT-PCR检测表明,BmPLRP1基因在家蚕5龄3天幼虫的头部、表皮、丝腺、生殖器、气管丛、中肠中有明显表达,而在血液和脂肪体中的表达量相对较低;对家蚕品种‘733xin’喂食经100 mg/kg NaF溶液浸泡过的桑叶后,实时定量PCR检测BmPLRP1基因在中肠、血液、丝腺、脂肪体中的相对表达量,结果表明均有所上调,推测该基因可能参与了氟化物侵染家蚕后的应答反应过程。     

用SSR标记进行家蚕日系品种资源指纹图谱的构建及亲缘关系分析

利用微卫星标记(SSR),在DNA分子水平上构建了家蚕84个日本系统二化性品种和9个多化性品种共94个材料的指纹图谱。用68对SSR引物扩增出705条有效带,最多的一对引物有31个等位片段,最少的仅有2个,平均每个引物10.4个。根据每个品种的指纹特征,利用UPGMA聚类法对结果进行分析,发现其SSR标记不但具有系统特异性,而且具有品种特异性,能够证明二化性日系品种与多化性品种在进化上属于显著差异的两个类群,较准确地将各品种按亲缘关系远近聚类。     

家蚕氨肽酶N家族基因在5龄幼虫中肠组织的表达分析

氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)是一种偏好水解蛋白质或寡肽N端中性氨基酸的酶,在鳞翅目昆虫中主要分布于中肠上皮细胞的刷状缘囊膜上,是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)伴孢晶体(Cry)毒素的重要受体蛋白。为了研究家蚕APN家族基因的表达特征,运用Real-time PCR技术检测分析该家族基因在不同家蚕品种幼虫中肠组织的表达差异以及同一家蚕品种幼虫中肠组织中该家族基因各个成员的表达丰度。在所有供试家蚕品种的幼虫中肠组织均可检测到APN家族基因的表达,但不同化性家蚕品种间APN基因的表达水平存在显著差异(P<0.05),而相同化性品种间的差异较小(P>0.05);在同一家蚕品种幼虫中肠组织中,APN2、APN4、APN5基因的表达量较高,而APN1及APN3基因的表达量较低。研究结果有助于进一步研究家蚕APN家族基因的作用机制,并为家蚕抗Bt品种的选育提供理论依据。