鸡传染性法氏囊病研究进展

鸡传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease, IBD)是由传染性法氏囊病毒(IBDV)引起的鸡的一种高度接触性传染病,该病主要感染3～6周龄的青年鸡,病毒在法氏囊的B淋巴细胞中迅速繁殖,损伤法氏囊的B淋巴细胞,引起严重的免疫抑制。临床上出现增重减少、死亡、机体严重脱水和骨骼肌出血。除直接引起鸡死亡与生产性能下降外,还可引起其免疫力下降,增加感染鸡对其他病原体的易感     

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒非结构蛋白nsp1α的表达及活性检测

为获得具有活性的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白1α(nsp1α),以BJ-4PRRSV nsp1α真核表达质粒pc DNA3.1-nsp1α为模板扩增nsp1α,克隆到原核表达载体p ET-28a,1 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导含有重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)。SDS–PAGE结果显示,nsp1α以包涵体形式高效表达,重组蛋白大小约为20 ku;Western blot结果显示,表达的重组蛋白能与小鼠抗His标签单克隆抗体反应;包涵体蛋白复性后,ELISA方法检测结果显示,重组蛋白能与1∶6 400稀释的PRRSV阳性血清反应。表明成功表达了nsp1α蛋白,且表达的重组蛋白具有较好的免疫学活性。     

小鼠IgGFc受体(moFcγRⅡ)稳定表达细胞系的建立及鉴定

为建立小鼠IgGFc受体(moFcγRⅡ)稳定表达的哺乳动物细胞系,PCR克隆小鼠moFcγRⅡ片段,构建真核表达载体pcDNAmoFcγRⅡ。转染COS-7细胞后通过G418抗性筛选和连续克隆,获得了在COS-7细胞表面稳定表达FcγRⅡ的真核细胞系。玫瑰花环试验结果显示其阳性率在90%以上。     

盐酸克伦特罗的残留及检测

本文回顾了盐酸克伦特罗（Clenbuterol,CL）作为生长促进剂在肉食动物体内的吸收、分布、代谢和残留状况，以及人们食用残留CL的肉品后引起的中毒事件，同时介绍了FDA，WHO及我国政府规定的CL肉品中的最大残留限量标准和常用检测技术。指出CL在动物体内具有吸收快、分布广，残留性积累和半衰期长等生物学特性。应用以酶免疫分析技术为基础的筛选法和以色谱技术为基因的确证法相 残留检测体系是防止CL非法使用和保障肉品安全的有效手段。     

猪瘟病毒E2蛋白酵母表达及其免疫活性研究

猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,呈世界性分布,对养猪业危害严重。猪瘟病毒属于黄病毒科、瘟病毒属,在自然条件下只感染猪。E2蛋白是猪瘟病毒的重要结构蛋白,也是猪瘟病毒的主要保护性抗原。以猪瘟病毒E2蛋白胞外区基因为模板,构建毕赤酵母表达载体pPICZαA-E2,并通过电转获得毕赤酵母X-33阳性克隆,经SDS-PAGE、Western blot鉴定筛选出猪瘟病毒E2蛋白表达菌株。通过亲和层析技术纯化蛋白,并将蛋白免疫动物,进行免疫原性分析。结果表明,猪瘟病毒E2蛋白在毕赤酵母中成功分泌性表达,经纯化纯度达95%以上;动物试验显示,该蛋白具有良好的免疫原性,为猪瘟病毒亚单位疫苗及相关检测技术的开发奠定了基础。     

抗猪瘟病毒中和性单克隆抗体的制备与鉴定

为了获得具有中和活性的抗猪瘟病毒(CSFV)单克隆抗体,分别将CSFV和杆状病毒表达系统表达纯化的CSFV E2蛋白与佐剂混合后免疫BABL/c小鼠,经杂交瘤细胞融合制备抗CSFV单克隆抗体,经过多轮亚克隆和免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)筛选,成功获得5D1、8H7、9A1和13B2共4株能够稳定分泌抗CSFV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。4株单克隆抗体轻链均属于κ型,其中5D1、8H7、13B2为IgG1亚型,9A1为IgG2c亚型。间接ELISA检测结果显示,4株单克隆抗体的腹水效价在2.56×10~5～1.02×10~6;IPMA效价分别为6.40×10~4、1.28×10~5、2.56×10~5、1.28×10~5;SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,4株单克隆抗体均能与经原核表达系统及杆状病毒表达系统获得的CSFV E2蛋白发生特异性反应;IPMA检测结果显示,4株单克隆抗体均能与CSFV发生特异性反应,而与牛流行性腹泻病毒(BVDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒(PCV2)均无交叉反应。病毒中和试验证实,单克隆抗体13B2具有中和活性,其中和效价为1.28×10~4。综上,成功筛选出4株能够分泌抗CSFV特异性抗体的杂交瘤细胞株,其中单克隆抗体13B2具有中和CSFV感染活性。     

猪伪狂犬病毒的分离与鉴定

从河南某发病猪场大批死亡仔猪的脾、肾及脑组织中分离到1株猪伪狂犬病毒(PRV)毒株,该毒株经细胞连续传代培养后,接种PK-15细胞能够产生明显的细胞病变(CPE),且能被PRV阳性血清中和.病毒对氯仿、乙醚敏感,56℃水浴30 min能使其灭活.将所分离的病毒接种家兔和小鼠,均出现明显的伪狂犬病临床症状.PCR鉴定结果表明,用gp50基因序列引物能够从该毒株上扩增出目的条带,将测序结果与GenBank中的5株PRV毒株进行比对分析,同源性达99％.证实所分离病毒为猪伪狂犬病毒.     

二氟沙星单克隆抗体的研制及其免疫学特性的鉴定

采用改进的碳二亚胺法,将半抗原二氟沙星(DIF)与载体牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联,制备得到二氟沙星全抗原DIF-BSA和DIF-OVA.采用紫外(UV),凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定;用BSA-DIF免疫BALB/C小鼠,间接ELISA和阻断ELISA选择细胞融合备用鼠;应用杂交瘤技术制备二氟沙星单克隆抗体(DIF mAB),并对其效价、亲和力和特异性等进行鉴定.结果表明,BSA与DIF偶联成功,分子结合比为1:4.7,筛选出1H10、2F12、4D8共3株敏感特异的杂交瘤细胞,间接ELISA效价细胞培养上清分别为1:5.12×102、1:3.2x101、1:2.56×102,腹水效价分别为1:2.56×105、1:1.28x105、1:6.4×104.同种亚型分别为IgG1、IgG1、IgG2a,亲和常数(Ka)分别为2.94×1010L/mol、1.72×1010L/mol和1.35×1010L/mol.亲和力最高的1H10对DIF的IC50为2.2ng/ml,单抗与其他氟喹诺酮类药物和磺胺类药物无交叉反应.通过试验获得高效价、敏感、特异的mAb,适用于动物性食品中DIF的残留检测的免疫学试验.     

猪囊尾蚴排泄分泌抗原Ts8B1蛋白原核表达条件的优化

研究了培养基、温度、诱导时间、IPTG和氨苄青霉素终浓度以及诱导前后温度变化等不同条件对重组菌菌体生长和融合蛋白表达量的影响,以期获得猪囊尾蚴排泄分泌抗原(Es Ag)Ts8 B1蛋白基因在大肠杆菌中的最大表达量.结果显示,使用TB培养基于37℃培养3 h后,采用终浓度为0.2mmol/L的IFrG和200mm0L/L的氨苄青霉素在32℃过夜诱导培养,pGEX-6p-1/TsSBl融合蛋白表达量最大,表达的融合蛋白约占菌体总蛋白的33%.SDS-PAGE表明p(;EX-6p-1/Ts8Bl融合蛋白大小约为33 kDa,与预计的分子量大小一致,Western blot分析表明其能与猪囊尾蚴多克隆抗体起特异性反应,并获得最大产量的融合蛋白.为研究其在猪囊尾蚴病检测中的应用价值奠定了基础.     

氯霉素单克隆抗体免疫金标快速检测试纸的研制及性能测定

以分泌抗氯霉素单克隆抗体(CAP mAb)杂交瘤细胞株的建立为基础,应用胶体金免疫层析试验(GICA)成功研制出CAP残留快速检测试纸(CAP_Strip),并对其性能进行了测定。结果表明,CAP_Strip的标准曲线呈典型的S型,符合4参数logit曲线拟合,目测检测限为0.5μg/L;与氯霉素琥珀酸钠的交叉反应为160%,与其他酰胺醇类和抗菌药物无交叉反应;其敏感性与竞争ELISA试剂盒相当,符合率为100%;10 min内显示结果,具有快速、敏感、特异、简便等特点,适合CAP残留快速检测的推广应用。