伏马菌素B1人工抗原的合成及鼠源多克隆抗血清的制备

本研究合成并鉴定伏马菌素B₁(FB₁)人工抗原,通过动物免疫制备敏感性高、特异性好的鼠源FB₁多克隆抗血清。采用碳二亚胺(EDC)法将FB₁分别与载体蛋白BSA和OVA偶联,合成免疫抗原FB₁-BSA和检测抗原FB₁-OVA,经鉴定后,分别按10和30μg/只的剂量免疫BALB/c小鼠,共免疫4次,每次间隔3周,最后1次免疫30d后,断尾采血,制备多抗血清。利用间接ELISA方法测定抗血清效价,间接竞争ELISA测定敏感性和特异性。结果表明,免疫的6只小鼠效价均达1∶104以上,3号小鼠多抗血清敏感性最好,半数抑制浓度IC₅₀为61.3ng/ml,且具有良好的特异性。本试验成功合成了FB₁人工抗原,并制备了敏感性高、特异性好的鼠源多克隆抗体血清,为FB₁单克隆抗体制备及其免疫学快速检测方法的建立奠定了基础。     

三疣梭子蟹Toll4基因克隆及其在病原和低盐胁迫中的表达特征分析

采用RACE技术克隆得到三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)TLRs家族的一个新基因,将其命名为Pt Toll4。该基因c DNA全长为4276 bp,5?和3?非编码区分别为339 bp和1252 bp,编码一个含有895个氨基酸、分子量为102.5 k Da、理论等电点为6.03的蛋白质。Pt Toll4蛋白是一个跨膜蛋白,存在胞外区LRR、LRRCT结构域及保守的胞内区TIR结构域。同源性及系统进化分析显示,Pt Toll4氨基酸序列与中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)Es Toll2的同源性最高,为61%。实时荧光定量PCR结果显示,Pt Toll4基因在血细胞中的表达量最高,在肝胰腺中的表达量最低。利用副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)和对虾白斑综合征病毒(WSSV)对三疣梭子蟹进行注射感染,结果显示,经WSSV感染后,Pt Toll4基因在血细胞中的表达量显著提高,在6 h时出现峰值,为对照组的5.03倍(P0.01)。经副溶血弧菌感染后,Pt Toll4基因仅在48 h略微出现上调,其余时间点与对照组无显著差异。由此推测,Pt Toll4基因在三疣梭子蟹应答WSSV的免疫过程中发挥了重要功能。此外发现,低盐胁迫显著抑制了Pt Toll4基因在三疣梭子蟹血细胞中的表达,这可能是导致低盐环境下三疣梭子蟹等甲壳类动物免疫力下降的原因之一。由此推测,Pt Toll4基因在三疣梭子蟹先天免疫过程中发挥了重要功能,本研究为深入开展三疣梭子蟹和其他甲壳动物的免疫调控机理研究提供了数据支持。     

中华蜜蜂防御素基因克隆及生物信息学分析

防御素是昆虫体内抵抗外界微生物的重要物质,中华蜜蜂对病原微生物具有较强的抵抗力。本研究利用PCR技术克隆了中华蜜蜂防御素基因,对得到的基因组序列进行了详细的生物信息学分析,发现中华蜜蜂与意大利蜜蜂防御素蛋白氨基酸序列的相似性达到92%,与其它物种也具有比较高的同源性,防御素蛋白存在比较明显的信号肽序列和跨膜区结构,这与其它昆虫的防御素蛋白的结构和功能相似,从而为进一步研究中华蜜蜂防御素的生物功能提供良好的铺垫。     

蛋用鹌鹑伴性羽色基因互作与连锁的关系

目的研究MITF基因在鹌鹑胚胎发育过程中的表达变化及其与羽色形成的关系,分析启动子甲基化对MITF基因表达的影响。方法利用RT-PCR克隆鹌鹑MITF基因mRNA的CDS区域并进行DNA测序,对得到的序列进行BLAST比对等生物信息学分析。利用RT-qPCR分析MITF基因在栗羽朝鲜鹌鹑和北京白羽鹌鹑胚胎发育第6、8、10、12和14 天的表达变化。克隆朝鲜鹌鹑和北京白羽鹌鹑MITF基因的启动子区域并进行DNA测序,利用BS-PCR分析启动子CpG岛的甲基化水平。结果鹌鹑MITF基因与日本鹌鹑同源基因相似度达99%,包含1 476 bp的开放阅读框,编码蛋白由492个氨基酸残基组成,没有信号肽和明显的跨膜区,成熟蛋白位于细胞核中。在胚胎发育的6~12 d,朝鲜鹌鹑MITF基因mRNA表达水平显著或极显著高于北京白羽鹌鹑(P<0.05或P<0.01)。鹌鹑MITF基因启动子区域包含丰富的顺式作用元件和1个346 bp的CpG岛,朝鲜鹌鹑MITF基因启动子区域的平均甲基化水平为18.52%,北京白羽鹌鹑的平均甲基化水平为29.63%,两者差异显著(P<0.05)。结论北京白羽鹌鹑MITF基因启动子区域高甲基化状态导致其表达水平下降,这与其羽色白化有一定的关系。     

朝鲜鹌鹑OCA2基因克隆及其多态性与羽色的相关性

【目的】克隆朝鲜鹌鹑(Korean quail)OCA2基因的cDNA序列,检测其在不同羽色(白羽和栗羽)群体胚胎发育不同阶段翅组织中mRNA的表达情况,探讨OCA2基因多态性对朝鲜鹌鹑羽色的影响,筛选可能与羽色相关的多态性位点。【方法】取白羽、栗羽朝鲜鹌鹑孵化6,8,10,12和14 d的胚胎翅组织,提取总RNA,RT-PCR扩增OCA2基因cDNA序列,利用实时荧光定量PCR检测OCA2基因mRNA在朝鲜鹌鹑胚胎发育不同阶段和不同羽色鹌鹑胚胎翅组织中的表达水平;用胚胎发育10 d时的cDNA样品扩增OCA2基因cDNA序列并进行生物信息学分析。以300羽白羽朝鲜鹌鹑和栗羽朝鲜鹌鹑孵化10 d时的胚胎为研究材料,采集翅组织样品,提取基因组DNA, PCR扩增OCA2基因,通过不对称PCR-SSCP方法结合测序确定基因型,分析不同基因型对朝鲜鹌鹑羽色形成的影响。【结果】朝鲜鹌鹑OCA2基因胚胎发育6～8 d时的表达量低于胚胎发育10～14 d时的表达量,且在10 d时达到最高。6～8 d时,OCA2基因的表达水平在2种羽色朝鲜鹌鹑胚胎中差异不显著; 10～14 d时,栗羽朝鲜鹌鹑OCA2基因mRNA的表达水平显著高于白羽朝鲜鹌鹑(P0.05)。OCA2基因CDS区片段大小为2 660 bp,含有24个外显子,开放阅读框长2 556 bp,编码含851个氨基酸的稳定疏水性蛋白。在朝鲜鹌鹑OCA2基因中检测到3个SNP位点,分别为外显子2上的c.93AG、外显子9上的c.999AG、3′UTR上的c.2569CT;群体遗传学分析显示,3个突变位点均表现为中度多态(0.25PIC0.5),χ~2检验表明朝鲜鹌鹑群体在3个SNP位点上均处于Hardy-Weinberg平衡(P0.05)。在3′UTR上的c.2569CT位点,栗羽朝鲜鹌鹑3种基因型(CC、 CT和TT)的频率分布与白羽朝鲜鹌鹑存在极显著差异(P0.01),说明该突变位点与鹌鹑羽色之间存在一定的关联性。【结论】白羽朝鲜鹌鹑翅组织中OCA2基因低表达可能与其羽毛白化有一定的关系,OCA2基因3′UTR上的c.2569CT突变与朝鲜鹌鹑羽色性状之间具有一定的关联性,可以作为研究朝鲜鹌鹑羽色的候选基因。     

燕子河流域崩塌地质灾害成灾机理分析

在分析燕子河流域地质灾害形成的地质环境背景及诱发因素的基础上,对燕子河流域崩塌地质灾害的类型、发育特征进行了分析,总结了流域内3种主要的崩塌地质灾害破坏模式及演化过程,并选取典型崩塌进行了稳定性研究。结果表明:燕子河流域崩塌地质灾害以岩质、小型、复合式、中低位、不稳定崩塌为主;崩塌在空间上主要分布在燕子河干流、主要支流河谷斜坡地带及康县—阳坝公路沿线人类工程活动密集的"一路一带"上,时间上主要集中于降雨较为集中的7—9月;崩塌的破坏模式主要有碎裂—坠落式、弯折—倾倒—滑移式、碎裂—滑移式,每种破坏模式经历4个阶段演化后形成灾害;典型崩塌稳定性计算得出暴雨是崩塌发生的主导诱发因素。     

大宝鸽、石岐鸽和杂交王鸽生产性能和肌肉营养成分分析

为了解大宝鸽、石岐鸽和杂交王鸽的生产性能和肌肉营养成分,本实验分别测定分析大宝鸽、石岐鸽、杂交王鸽3种鸽子0～30日龄及成年鸽（3年龄鸽）生长性能、30日龄鸽屠宰性能、成年鸽（3年龄鸽）胸肌中的常规营养成分、氨基酸及脂肪酸含量。结果表明：大宝鸽的宰前活重和胸肌重高于石岐鸽和杂交王鸽（P<0.05）,但是屠宰率低于石岐鸽和杂交王鸽（P<0.05）;大宝鸽的生长速度、体重、体斜长、龙骨长、胸宽、骨盆宽及胫长高于石岐鸽和杂交王鸽（P<0.05）;杂交王鸽和大宝鸽的肌肉蛋白质含量高于石岐鸽（P<0.05）,杂交王鸽的肌肉脂肪含量低于大宝鸽和石岐鸽（P<0.05）,杂交王鸽的肉质与大宝鸽和石岐鸽相比更符合高蛋白低脂肪的理想型可食用肉质消费理念,并且杂交王鸽的风味氨基酸含量与大宝鸽相似且高于石岐鸽（P<0.05）,但是不饱和脂肪酸含量低于大宝鸽和石岐鸽（P<0.05）。研究表明大宝鸽的宰前活重和生长速度、杂交王鸽高蛋白低脂肪的肉质和屠宰率以及石岐鸽的屠宰率都是表现突出的遗传特性,可以作为后期专门化品系培育选择的遗传特性。     

牛Smad 9基因cDNA克隆及生物信息学分析

Smad 9属于R-Smads,在TGF-β信号传导过程中起着重要作用。本研究利用生物信息学方法,结合RT-PCR技术和SMARTRACE技术,得到全长为1 871 bp的牛Smad 9基因cDNA序列。通过核酸序列分析发现,牛Smad 9基因编码345个氨基酸残基,牛Smad 9蛋白无跨膜区和信号肽序列,该蛋白与人、小鼠、大鼠和红原鸡在氨基酸序列上分别有78.84%,79.21%,77.88%和70.38%的同源性。通过多组织RT-PCR分析发现,牛Smad 9基因的组织表达谱很广,在卵巢、肝、肌肉、小肠、脂肪、子宫、肾脏、心肌、肺、胰腺、睾丸、乳腺组织中均有表达。     

鹌鹑SLC24A5基因多态性与羽色性状的关联性分析

为研究SLC24A5基因与鹌鹑羽色性状的关系,试验采用RT-qPCR方法研究朝鲜鹌鹑和北京白羽鹌鹑在胚胎不同发育时期的mRNA表达水平。结果显示：SLC24A5基因在朝鲜鹌鹑胚胎发育时期的表达水平极显著高于北京白羽鹌鹑（P<0.01）;鲜鹌鹑和北京白羽鹌鹑的3种基因型频率分布差异极显著（P<0.01）。位于外显子1的SNP1(c. A5T)和外显子6的SNP2(c. G703A)均为中性位点,但SNP2(c. G703A)位点造成的编码蛋白G235S位点突变并不保守,属于多变性位点。研究表明,SLC24A5基因与鹌鹑羽色性状有关联性,可以为鹌鹑羽色育种提供理论依据。     

分泌抗春雷霉素单克隆杂交瘤细胞株的建立 及免疫学特性鉴定

【目的】制备高灵敏、高特异性的抗春雷霉素单克隆抗体,并对其免疫学特性进行鉴定。【方法】采用EDC法将KSM分别偶联于载体蛋白BSA和OVA上,分别合成免疫原KSM-BSA和包被原KSM-OVA,经SDS-PAGE鉴定后,免疫Balb/c小鼠,免疫间隔4周,4次免疫后,利用间接ELISA和间接竞争ELISA测定其多抗血清效价和敏感性,选出效价高、敏感性好的小鼠进行细胞融合,经过多次亚克隆筛选出分泌高敏感的特异性抗KSM单克隆抗体的杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备抗KSM的单克隆抗体并对其免疫学特性进行鉴定。【结果】SDS-PAGE鉴定结果显示KSM-BSA成功偶联,间接ELISA检测显示免疫的6只小鼠血清效价均达1:104以上,其中3号小鼠多抗血清敏感性最好,半数抑制浓度IC50为73.9ng•mL-1,融合后筛选出两株杂交瘤细胞株1G7和2C8,亚型均为IgG1型,其细胞上清效价分别为1:5.12×103 和1:1.28×103,腹水效价分别为1:5.12×105和1:2.56×105,抗KSM的单克隆抗体对春雷霉素的IC50为8.902ng•mL-1,与其它竞争物的交叉率均小于0.03%。【结论】本试验成功合成了春雷霉素人工抗原,并制备了敏感性高、特异性好的单克隆抗体,为春雷霉素免疫学快速检测方法的建立奠定了基础。