口蹄疫病毒致病机理研究进展

利用经典的生物化学和物理分析手段来研究感染口蹄疫病毒(FMDV)的细胞能揭示FMDV各个蛋白的结构和功能,而通过对FMDV遗传差异的研究可知病毒蛋白的正确结构在病毒的复制和致病中起着重要作用。近年,利用基因工程的方法研究人员可直接验证FMDVRNA结构、编码区和多聚蛋白在FMDV复制和致病的相关推测。     

禽流感病毒的分子生物学研究进展

禽流感是一种主要感染禽类的烈性传染病,能引起巨大的经济损失。该病也能传染人,因此,对禽流感病毒的研究已成为一大热点。目前研究的重点主要集中在其病毒的分子生物学方面,以期能更有效地防制本病。文章从基因组及其编码的蛋白质、病毒毒力、毒力变异、基因疫苗和诊断技术等方面系统论述了禽流感病毒的分子生物学方面的研究进展,为进一步研制禽流感病毒基因工程疫苗及诊断制品,预防该病提供了理论基础。     

C型口蹄疫病毒VP1基因的原核表达及重组蛋白的纯化

利用PCR技术扩增获得C型口蹄疫病毒VP1基因,将其克隆到原核表达载体pET-30α(+)上,构建重组表达质粒pET-VP1。质粒pET-VP1转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导VP1基因的表达,收集不同时间的菌液进行SDS-PAGE、Western blot分析,结果得到分子量约为33 ku的目的条带,表达产物占菌体总蛋白的35%,且该目的条带能被C型FMDV阳性血清识别,说明VP1基因在大肠杆菌中得到高效表达。融合表达蛋白经镍柱纯化,重组蛋白纯度达90%以上。     

H9N2亚型禽流感病毒M基因的克隆及序列分析

从鸡胚尿囊液中提取H9N2亚型禽流感病毒的RNA,根据已发表的A型流感病毒(AIV)的核苷酸序列,设计一对特异引物,采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)成功地扩增了AIV的M基因。将M基因的cDNA克隆后进行了序列测定,测序结果表明所扩增的1 192 nt片段包含了完整的M基因的两个开放阅读框。核苷酸序列比较分析结果表明:该毒株与A/Hong Kong/1073/99(H9N2)、A/Duck/Hong Kong/380.5/2001(H5N1)、A/Duck/NY/191255-79/02(H5N2)相比,核苷酸序列的同源性在92.2%~96.1%之间,其相对应的氨基酸序列的同源性在91.7%~96.3%之间。     

口蹄疫病毒对牦牛持续性感染的分析

利用口蹄疫病毒株Akesu/58感染牦牛来建立口蹄疫病毒持续性感染动物模型。连续饲养12个月,每月采集牦牛血液并利用酶联免疫吸附试验检测中和抗体的效价和3ABC非结构蛋白的OD值。3ABC非结构蛋白OD值的数据统计采用SPSS11.5软件包中的Curve Estimation进行曲线回归。利用体外细胞实验来检测口蹄疫病毒毒力的变化情况。结果显示,口蹄疫病毒的毒力是逐渐下降的,中和抗体和3ABC的含量均呈下降趋势,并且可人为地划分两个阶段。由于口蹄疫病毒凭借VP1蛋白、L和3C蛋白酶对牦牛的致病性,在第一个阶段内,体液免疫被认为是牦牛机体抗击FMDV感染的主要形式;在第二阶段,细胞免疫被认为是机体抗击FMDV感染的主要形式。     

口蹄疫病毒强毒株China/99 P2区核苷酸序列测定及比较分析

以口蹄疫病毒强毒株China/99PNA为反转录模板，用一对特异性引物扩增目的cDNA，然后与pGEM-T Easy载体连接并转化J109菌株，再经重组质粒电泳、PCR和EcoR1酶切鉴定，序列测定和分析结果表明，该强毒株与A12、O1K和TW45毒株的核苷酸差异率分别为7．78％、6．62％ 13．19％，推导的氨基酸序列差异率分别为1．23％、1．84％和5．73％，4个毒株序列比较发现，China/99、O1K和TW45三毒株的2A／2B连接处为甘氨酸／脯氨酸，A12为精氨酸／脯氨酸，而且T－C转换率和A－G转换率较高，是点突变的热点核苷酸，氨基酸差异主要存在于2B和2C蛋白中，2A基因较为保守，2B蛋白和第1－4，63－67，73－78，83－91，116－121和126－131区域，2A蛋白的第4－9区域和2C蛋白的第9－13，22－25，91－96，150－159，179－188，201－207和258－262区域可能是重要的活性中心。     

口蹄疫病毒3D基因真核表达载体pEGFP-3D的构建及其融合蛋白分子在BHK细胞中的定位

为研究口蹄疫病毒RNA聚合酶3D基因的分子生物学特性及定位,构建了3D基因真核表达载体pEGFP-3D,观察了3D在BHK-21细胞中的瞬时表达情况.从重组质粒pMDl8.T-3D扩增到3D基因,与pGEM-T easy载体连接,将鉴定为阳性的重组质粒pGEM-3D与表达载体pEGFP-N1分别经Barn H Ⅰ/Hind Ⅲ酶切,进行定向亚克隆;重组表达质粒pEGFP-3D经PCR、酶切鉴定.阳性质粒进行测序.利用脂质体介导阳性pEGFP-3D质粒转染BHK-21细胞.免疫组化检测转染细胞中3D基凶表达情况和3D基因在细胞中的定位,Western blotting验证pEGFP-3D融合基因的表达.结果表明,成功构建了重组表达质粒pEGFP-3D,并在BHK-21细胞中进行了表达.免疫组化分析表明,3D蛋白主要定位于细胞核;Western blotting证实pEGFP-3D融合蛋白在80 kDa处出现阳性条带,说明表达的外源蛋白具有免疫活性.pEGFP-3D表达载体转染细胞后很快就能通过观察荧光蛋白而检测出基因的瞬时表达情况,为基因转染研究中确定转染效率、3D的表达情况及蛋白定位等提供了直观的靶标,有望应用于FMDV聚合酶分子的生物学特性研究.     

家兔微注射基因胚胎自体移植和异体移植的比较试验

冲取３２只超排或自然发情配种的母兔早期胚胎４２７枚，选其中导入抗猪瘟Ｒｉｂｏｚｙｍｅ基因后的３４７枚优质胚胎分组移植不同受体。第一组将９３枚微注射卵移植到７只冲卵后的供体输卵管内，６只妊娠并产仔３２只。经ＰＣＲ检测３２只仔兔中有２只整合了外源基因。第二组将２５４枚微注射卵移植异体受体１３只，妊娠６只并产仔２０只。经ＰＣＲ检测２０只仔兔中有２只整合了外源基因。     

双峰驼诱导排卵因子结构的研究

应用岛津紫外分光光度计系统地扫描并记录了公驼精清，各活性组分以及诱导排卵因子的紫外吸收光谱。扫描结果证明：公驼诱导排卵因子（OIF）在精清内相对稳定的原因，是OIF在精清内由多层分子量不同、性质各异的蛋白质所包裹，从而证明了我们以前的推测。     

整联蛋白αvβ3与口蹄疫病毒感染

病毒受体是决定病毒宿主特异性和组织嗜性的主要因素之一,其本质是糖蛋白、蛋白聚糖、脂类或糖脂,多数属于蛋白质.大多数病毒受体分布于细胞表面,病毒需要细胞受体的参与才能进入细胞并进行复制、转录、包装成病毒粒子.整联蛋白αvβ3具有多种配体其主要包括:细胞间配体、细胞外基质(extracellular matrix,ECM)配体、血管细胞黏附配体,还能识别多种病毒表面上特定的"精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD)序列",并介导病毒感染细胞的过程,口蹄疫病毒可利用VP1的G-H环(约为130～160残基)上的此序列吸附整联蛋白αvβ3感染细胞.本文就整联蛋白αvβ3的结构、分子生物学特性以及其介导的口蹄疫病毒感染细胞机制作一综述.