携带遗传转化质粒的农杆菌在无抗性选择压二次悬浮下的质粒稳定性

本试验对携带不同目的基因和启动子的农杆菌菌株在去掉抗生素条件下进行菌液二次悬浮时的质粒稳定性进行了研究。结果表明：GV3101菌株中的几丁质酶基因质粒与AGL1菌株中的CBF3/rd29a质粒非常稳定,未发生质粒丢失现象;其次是LBA4404菌株中的CpTI质粒,虽发生个别质粒丢失,但与对照相比没有显著差异;携带CBF3/rd29a质粒的EHA105菌株悬浮培养12h后质粒发生明显丢失;含β-1,3葡聚糖酶基因质粒的EHA105菌株、含CBF3/CaMV35S质粒的GV3101菌株悬浮培养10h后质粒发生明显丢失;EHA105菌株CBF1/rd29a质粒和AGL1菌株CBF3/CaMV35S基因质粒最不稳定,分别悬浮培养6h和4h后即发生质粒明显丢失,且随悬浮培养时间的延长,质粒丢失率显著增高。质粒丢失程度与目的基因、启动子和农杆菌菌株三要素中的单一因素没有规律性联系,而是与目的基因、启动子和农杆菌菌株的组合有关;同时,在悬浮时间为0.5～6.0h范围内,质粒丢失主要与菌液浓度有关,而与悬浮时间关系不大;直接吸取一次悬浮液或离心后分别悬浮于细菌培养液和植物培养液等不同的悬浮培养方式下质粒稳定性没有差异。     

转CpTI基因苹果种植地外源基因残留及对土壤微生物的影响

为研究转Cp TI基因苹果对土壤生态系统的影响,本研究分别提取8年生转基因嘎拉苹果植株根际土、根围土和表层土的DNA,PCR扩增检测土样中的外源Cp TI基因。结果显示：采集的转基因苹果根围土和根际土中均检测到外源Cp TI基因,两个株系的表层土检测到了外源Cp TI基因;含有外源基因的土壤分离培养的微生物中未检测到Cp TI基因,表明外源Cp TI基因在苹果种植地有残留,但在本研究条件下未发生向根系土壤可培养微生物的水平转移。进一步利用灭菌基质均匀喷洒微生物菌剂后移栽嘎拉、富士、王林转基因苹果植株的方法,研究转基因植株对土壤微生物的影响。结果表明：转基因苹果对根际土中的放线菌无明显影响;移栽30~60 d根际土中的细菌和真菌数量显著多于对照;随着移栽时间延长,差异程度减小,移栽90 d时,3个品种转化植株与对照根际土细菌含量以及转基因嘎拉和王林根际土真菌数量均无显著差异,说明转基因苹果对土壤微生物的影响非常有限。     

葡萄生长调控因子GRF家族基因的鉴定及表达分析

开展葡萄生长调控因子GRF(Growth-regulating factor)家族成员的基因结构、蛋白保守基序、亚细胞定位预测、同线性、系统进化树及顺式作用元件等分析;利用qRT-PCR技术开展有核和无核葡萄不同组织器官、种子发育不同时期及激素响应表达模式分析。葡萄GRF家族共有8个成员,其中7个分布于6条染色体,编码氨基酸数为213～604,所有成员均定位于细胞核。根据进化关系分为4组(A～D),同组VvGRF的外显子—内含子结构、保守基序数和类型均具有保守性。所有葡萄GRF蛋白N端均含有QLQ和WRC保守结构域,C端至少含有TQL或FFD结构域之一。同线性分析发现,VvGRF3和VvGRF4存在并联重复。VvGRF启动子区发现大量与生长发育、激素响应及胁迫响应相关顺式作用元件。大部分VvGRF在营养器官叶片中高表达,VvGRF2在生殖器官花和果实中高表达;VvGRF3和VvGRF6在无核葡萄种子发育过程中表达量显著高于有核葡萄,而VvGRF8在有核葡萄种子发育前期表达量显著高于无核葡萄;VvGRF响应GA₃和IAA诱导,且大部分基因在处理0.5或1 h后下调。     

杜梨根癌病原菌质粒类型鉴定及枯草芽孢杆菌对其抑制研究

以杜梨根瘤为试材,采用分子生物学方法、牛津杯法和指示植物接种法,研究了杜梨根癌病原菌的质粒类型及枯草芽孢杆菌对杜梨根癌病原菌的影响。结果表明:从1年生杜梨根部冠瘿瘤上分离、纯化、培养菌株,得到4株与根癌病原菌相似菌株,对之进行PCR扩增,此4株菌株均获得特异性目的条带,鉴定为根癌土壤杆菌胭脂碱类型。将病原菌接种指示植物向日葵幼苗,4株菌株均有致病性。经室内离体试验,供试的9株枯草芽孢杆菌对病原菌表现不同程度的抑菌效果;接种指示植物试验中,菌株9076和9161过滤发酵液能够完全抑制冠瘿瘤的生长。     

温度和渗透压对苹果试管苗延缓生长法种质保存的效应

以富士、乔纳金试管苗为试材,通过在继代培养基中加入不同浓度的蔗糖、琼脂、甘露醇提高渗透压或置于不同温度下,筛选合适的延缓生长的条件。试验结果表明:低温条件抑制试管苗生长效果明显,适宜的低温处理为接种后在25℃培养室条件下缓苗5～10d移至8℃培养,可延长保存时间至1年半以上,茎尖成活率达100%;提高培养基琼脂、蔗糖浓度或添加甘露醇都能抑制试管苗生长,且随浓度增加,抑制作用愈发明显,但琼脂、甘露醇处理中有部分茎尖死亡;综合比较,8℃低温、60g/L蔗糖处理延缓试管苗生长效果较好。同一处理下品种间有差异,富士苹果延缓生长的效果好于乔纳金。     

β–1,3葡聚糖酶基因转化提高苹果对斑点落叶病的抗性

为提高苹果抗病性,利用根癌农杆菌介导的叶片转化法,将带有NPTⅡ筛选基因、GUS标记基因及β–1,3葡聚糖酶目的基因质粒导入‘富士’和‘嘎拉’苹果。具有卡那霉素(Kan)抗性的转化株系,经GUS组织化学染色及PCR扩增检测,得到17个‘嘎拉’阳性株系和11个‘富士’阳性株系。选取‘嘎拉’和‘富士’各3个阳性株系进行Southern blot检测,结果表明外源目的基因已整合到所试转化株系中。选取‘嘎拉’及‘富士’各5个阳性株系进行半定量RT-PCR检测,除1个‘富士’株系没有条带外,其余株系均有阳性条带,且各条带的明亮清晰程度有差别,说明不同转基因株系中目的基因的表达量有差异。转化植株离体叶片接种苹果斑点落叶病菌进行抗病性表型检测结果证实,‘嘎拉’10个转化株系中8个株系表现抗病,7个‘富士’转化株系中2个株系表现一定的抗病性,抗病性的增强与目的基因的表达水平有关。     

‘阳光玫瑰’葡萄试管苗热处理结合茎尖和腋芽培养脱毒技术研究

为进一步优化葡萄试管苗脱毒体系,以携带葡萄蚕豆萎蔫病毒（GFabV）、沙地葡萄茎痘相关病毒（GRSPaV）、葡萄灰比诺病毒（GPGV）、葡萄卷叶相关病毒–3(GLRaV-3)和葡萄病毒E(GVE)共5种病毒的‘阳光玫瑰’葡萄试管苗为材料,研究了热处理方式和时间以及热处理后茎尖和腋芽培养对脱毒的影响。结果表明,热处理方式影响试管苗的存活率和脱毒效率,以38℃/光照8 h+32℃/黑暗8 h变温处理效果最佳,其次为38℃/光照16 h+32℃/黑暗8 h变温处理以及38℃恒温/（光照16 h+黑暗8 h）处理。取38℃/光照8 h+32℃/黑暗8 h热处理10、15、20、25、30和40 d的试管苗1.5 mm左右的茎尖和茎尖下第1、2腋芽接种培养,茎尖存活率高于腋芽,繁殖成苗后检测,均脱除了上述5种病毒,其中热处理10 d的平均脱毒率为52.38%,25和30 d的脱毒率均达100%;随热处理时间延长,接种茎尖和腋芽的存活率下降,故热处理时间以25 d为宜。     

植物信号转导对‘夏黑’葡萄冬芽休眠解除的调控

本研究2016年-2017年以生态休眠状态下的‘夏黑’葡萄冬芽为试材,经单芽扦插处理、用转录组方法辅以生理指标测定,探讨了影响葡萄冬芽休眠解除的关键因子。单芽扦插7 d (EB1)和扦插14 d (EB2)后冬芽转录组测序均得到45 Mb以上的Clean Reads,经过滤、拼接、数据库比对均得到25 000以上转录本。从基因表达分析看EB2与EB1相比,1 051个基因上调表达,587个基因下调表达。差异表达基因(DEGs) GO富集分析发现葡萄冬芽自然休眠解除过程中DEGs主要富集在催化活性、结合、代谢过程和单有机体过程,进一步KEGG代谢途径分析发现植物信号转导途径是休眠解除的重要参与环节,尤其赤霉素(gibberellin,GA)和脱落酸(abscisic acid, ABA)代谢与休眠解除关系密切,芽子休眠解除过程中的内源激素变化和信号转导路径上相关基因qRT-PCR也验证了这一点。因此本研究认为内源激素和植物信号转导是调控葡萄冬芽自然休眠解除的重要因子之一。     

皇家夏天葡萄离体叶片再生体系的建立

叶片再生效率的高低直接影响目的基因转化的成功率,为建立稳定、高效的葡萄离体叶片不定芽再生体系,以优良无核葡萄品种皇家夏天为试材,取试管苗顶端1￣3叶位幼嫩叶片,研究了基本培养基成分、生长调节物质的种类和浓度、碳源等因素对叶片不定芽再生的影响。结果表明:供试WPM、1/2MS、B5和NN694种基本培养基,均可诱导其叶片再生不定芽,差异不显著;碳源以添加10￣20g/L的葡萄糖或食用白砂糖较好;培养基中附加3.0mg/L的6-BA与0.05mg/L的IAA配比利于出芽和成苗,应用TDZ虽出芽较多,但芽丛多畸形、出苗困难,不宜使用。     

葡萄叶盘法基因转化中抗生素种类和浓度的筛选

本研究以优良无核葡萄品种莫利莎葡萄试管苗为试材,研究了卡那霉素（Kan）、潮霉素（Hyg）对葡萄继代苗生长和离体叶片再生的影响,以确定叶盘法基因转化的选择压和转化体的筛选浓度;同时研究了不同浓度的头孢霉素（Cef）和羧苄青霉素（Carb）对葡萄离体叶片再生的影响,以确定侵菌共培养后合适的抑菌抗生素种类和浓度。试验结果表明葡萄继代苗对Hyg的敏感性强于Kan,葡萄遗传转化更适合使用潮霉素磷酸转移酶基因作为选择标记。Hyg 3.0mg/L即达到继代苗致死浓度,可作为转化后抗性苗的筛选浓度,Hyg 0.8mg/L完全抑制叶片不定芽的分化,可作为叶盘法转化时抗性芽的选择压。葡萄叶盘法基因转化中抑制农杆菌生长的抗生素可选用Cef 300mg/L或Carb 400mg/L,但对不定芽的分化有抑制作用。