元蛋白质组学在土壤微生物生态功能研究中的应用

元蛋白质组学是近年出现的一种基于蛋白质组学对微生物群落进行研究的新技术,其定义为对特定环境的所有微生物蛋白质进行的即时的、大规模的分析。虽然目前对元蛋白质组学的研究还处在起步阶段,但是它已在特定环境的微生物研究中显现出其强大的功能。本文通过对目前元蛋白质组学常用研究策略和技术进行比较,概述土壤元蛋白质组的提取、纯化、分离与功能鉴定等方面的研究现状,并对土壤元蛋白质组学研究的意义进行了展望。土壤元蛋白质组学的发展深受提取方法的影响,现有的方法很难提供既可成功分离又易于鉴定的蛋白质,而土壤蛋白鉴定的主要问题在于土壤蛋白质含量低,通过质谱分析对蛋白质鉴定时缺乏足够的序列-数据库信息。一旦这些问题得以解决,土壤元蛋白质组学便能在土壤微生物生态功能研究方面得到更加广泛和深入的应用。     

生物表面活性剂产生菌的分离培养及其产物特性研究

从加油站受石油污染的土壤中分离到1株高效产生物表面活性剂的菌株,经鉴定为气生单孢菌(Aeromonas sp.)。并对其发酵液表面活性剂性能及稳定性进行分析,最佳条件下发酵液的表面张力可由70.2 mN/m 降至28.9 mN/m,对温度、pH、矿化度有较好的稳定性,维持85 %以上油水乳化液稳定时间达到350 h。对其发酵条件进行了优化,确定表面活性剂产生最适C源为2 %甘油,以硝酸盐和铵盐作为N源对表面活性剂产生无影响。对其产生物表面活性剂进行提纯,经TLC分析初步确定该表面活性剂为糖脂类化合物。     

甲基对硫磷降解菌DLLBR在青菜及根际土壤中的定殖研究

将 GFP 基因标记的甲基对硫磷降解菌 DLLBR 接入 100 ml LB 培养基,过夜培养达到 1010cfu/ml,浇灌到盆钵试验的 800 g 土壤中,20 天后用激光共聚焦显微镜检测其在小青菜植株根部和植株内的定殖及分布。结果表明标记菌株能够在植株根圈较好地定殖,也能在植株内定殖。30 天后将植株各段研磨破碎,涂布 LB 平板计数发光菌落数,在根内的定殖数为 104cfu/g 根,在茎内的定殖数为 102cfu/g 茎。结果还发现与不接菌的对照相比,处理促进了植株内细菌群落结构的变化,尤其是芽孢杆菌的种类和数量明显增加。接菌 45 天后通过土壤计数检测发现,标记菌株在土壤中的存活力很高,能达到 106cfu/g 土,同时也发现与对照相比,接菌的土壤细菌群落结构明显发生了变化,细菌种类变化不大,但芽孢杆菌的数量明显增加。     

以质粒载体构建土壤宏基因组文库的研究

从土壤中提取土壤总DNA,切割成一定长度的DNA片段并连接到载体上,然后转化宿主菌,形成一个重组DNA文库即宏基因组（metagenome）文库.目前对宏基因组的研究在国际上是土壤微生物学研究的前沿领域和热点.文库构建后可以根据宿主细菌获得的功能筛选相应的克隆;也可以用已知的探针分离目的基因片段,加上表达调控元件后获取活性产物,所以通过宏基因组文库可以规避微生物培养的限制而寻找新的功能基因或者直接筛选活性物质;在早期宏基因组还被用来研究土壤微生物的遗传多样性.因此构建宏基因组文库是研究微生物分子生态学和开发微生物资源的强有力工具.本研究从土壤中直接分离DNA,部分酶切后分别回收2～6kb和6～9kb片段,然后分别与pUC19质粒载体连接,连接产物转化大肠杆菌DH5α构建了土壤宏基因组文库,实验中比较了不同DNA片段长度和不同的转化方法对文库构建的影响.     

免耕水稻土壤中细菌多样性及其空间分布的研究

采用基因指纹图谱ARDRA分析和RFLP分析，对免耕水稻土壤中的细菌多样性及其在0—5、5-10、10-15cm土层的空间分布进行了研究。结果表明：在不同层的水稻土壤环境中，细菌种类非常丰富，但由于其多样性受土壤水分或土壤层次等多种因子的影响，在不同层土壤环境中其多样性存在差异。表层土壤环境中细菌种类最丰富，多样性最高，且基因型中无明显的优势类群。10-15cm土层的细菌种类相比之下最少，且基因型中有相对的优势类群。不同层的土壤环境间细菌群落的相似性较低，表层土壤的细菌克隆文库与5-10cm的文库的Jaccard指数是20．65％，与10—15cm的文库的Jaccard指数仅为8．31％。5—10cm的文库与10—15cm的文库的Jaccard指数为38．75％。表明细菌群落结构以及土壤空间隔离的复杂性。     

高效除磷工程菌Pseudomonas putida GM6-PPK1的构建及其除磷能力研究

ppk1 基因编码的多聚磷酸盐激酶主要负责多聚磷酸盐的合成,其表达量的高低直接决定聚磷菌的聚 P 能力的强弱.Pseudomonas putida GM6 是从 EBPR 好氧池活性污泥中分离获得的一株具有聚 P 能力的菌株,该菌株含有两个编码多聚磷酸盐激酶的基因(ppk1 和 ppk2).通过 PCR 从高效聚磷菌株总 DNA 中扩增得到了 ppk1 及其启动子,并定向克隆到 pBBRMCS-5 载体上,构建了重组质粒 pMEPE-PPK,在辅助质粒 pRK2013 的帮助下,通过三亲接合将 pMEPE-PPK 转移到原始菌株 GM6 中,获得的工程菌 P. putida GM6-PPK1.GM6-PPK1 除 P 能力较原始菌株 GM6 和对照菌株 GM6-P5 提高了 54%,生长能力较原始菌株也有一定增强.通过模拟 EBPR 工艺,发现 GM6-PPK1 在厌氧/好氧交替的环境条件下强化表达不但提高了菌体好氧段的吸 P 能力,而且厌氧段 P 的释放和 PHA 的合成较之原始菌株也有显著增加.     

培养方法对土壤可培养细菌多样性的影响

提高土壤微生物的可培养性,获得纯培养微生物菌株,是微生物生态学研究的基础。采用三种培养基对土壤细菌进行分时段计数,以细菌通用引物扩增细菌16S rDNA片段,用限制性内切酶HhaI酶切PCR产物,对酶切图谱进行分型,研究不同培养方法对土壤细菌多样性和可培养的影响。结果表明,LB、CSEA、W SA培养基192 h后每g干土获得的细菌数量分别为14.84×107、10.27×107和6.91×107CFU,但微生物多样性指数以W SA为最高,LB多样性指数最低;三种培养基培养的细菌菌群有一定的相似性,LB和CSEA培养基间的Jaccard指数为57.69%,LB和W SA培养基之间为53.13%,而CSEA和W SA培养基的相似性指数达66.67%;16S rDNA测序结果表明,所获得的土壤细菌优势种群在分类方面主要属于γ-和β-变形杆菌以及放线菌亚门,其中某些OTUs中的16S rDNA序列与Burkholderiaceae bacterium、Rhodococcus和Mycobac-terium属具有较高的同源性,推测其细胞能够分泌复苏促进因子,有效地提高土壤细菌的可培养性。     

外源16S rRNA在大肠杆菌中的可替换性研究

16S rRNA对于构建功能性核糖体是十分重要的,人们普遍将其作为原核生物进化中保守的系统发育标志.为了进一步研究16S rRNA的进化,本文将Escherichia coli中最后一个拷贝的16S rRNA基因替换为Bacillus subtilis的16S rRNA 基因,得到了菌株SQ110BSX.菌株SQ110BSX的代时与出发菌株SQ110基本一致,但是SQ110BSX表现出冷敏感性,而且rRNA/蛋白比值为SQ110的148%.实验结果表明,菌株SQ110BSX中的核糖体效率明显下降.由于E.coli和B.subtilis在遗传距离上较远,两者的可替换性证明了16S rRNA的高度保守性.     

转基因抗虫棉对茎部内生细菌多样性的影响

比较转Bt基因抗虫棉与其母本茎部内生细菌多样性,为评估转基因棉花生物安全性提供基础数据.采用平板培养方法对转基因棉花(中棉30,TC)与其母本(中棉16,CC)茎部内生细菌进行分离与计数,用细菌的通用引物扩增细菌的16SrDNA片段,进行RFLP分析.采用培养方法分离与计数所得的棉花茎部内生菌数量为105 cfu/g;...     

高效聚磷菌株GM1的分离和聚磷特性研究

采用纯培养结合蓝白斑筛选法从土壤中筛选到一株高效聚磷菌,初步鉴定为费氏柠檬酸杆菌属(Citrobacterfreundii),命名为GM1。GM1在LB、YG和MOPS培养基上均可正常生长,其生长pH在5·5至8·5之间,最适生长pH为7·5。该菌在不同的培养基上最适生长温度不同,在LB培养基上为37℃,YG和MOPS-葡萄糖培养基上为30℃。在好氧条件下MOPS培养基培养24h后,GM1菌体含磷量为11·5%;上清液磷浓度由43·8mgL-1下降为14·7mgL-1,磷去除率达69%,poly-P染色显示菌体中有异染粒。GM1具有较强的聚磷能力。