贵州省生态畜牧业发展成效及高质量发展探讨

文章对2014年以来贵州省加快推进山地生态畜牧业的发展成效进行梳理总结,系统分析存在问题与困难,针对痛点难点,围绕产业发展方向提出路径措施,并立足要素保障探索流通体系改革和金融支持创新,以期为贵州生态畜牧业高质量发展和助推脱贫攻坚、助力乡村振兴战略实施提供理论参考。     

安卡拉病毒贵州流行株penton基因分子特性分析

为了解安卡拉病毒贵州流行株penton基因分子特征,本试验参考GenBank上FAdV基因序列设计合成特异性引物,对penton基因CDS区进行扩增,运用生物信息学软件对penton基因的核苷酸序列、蛋白质理化性质、信号肽、二级结构、三级结构和B细胞表位进行分析。结果显示,3株FAdV（GZ-BJ、GZ-QL、GZ-LPS）penton基因片段大小均为1 578 bp。系统进化树分析显示,GZ-BJ、GZ-QL、GZ-LPS均属于FAdV-4型,3株FAdV-4核苷酸同源性在99.9%~100%之间,推导氨基酸序列同源性在99.8%~100%之间;与国内其他分离株、国外分离株差异不大。蛋白理化性质分析显示,该蛋白属于不稳定的、不具有跨膜结构的亲水蛋白,其二级结构主要以无规则卷曲为主（54.29%）;结构域预测结果显示,penton蛋白只含有一个低复杂度区域;B细胞表位预测发现,penton基因编码的氨基酸可能存在3个优势抗原表位区,分别为5-171、207-236和420-462位氨基酸处。本试验结果表明,安卡拉病毒penton基因相对保守,存在多个优势抗原表位,可作为安卡拉病毒防控研究靶蛋白,为该病毒防控与致病机理研究奠定基础。     

山羊痘病毒SYBRGreen I荧光PCR检测方法的建立

为建立山羊痘病毒（goat pox virus,GPV）的SYBR Green I荧光PCR方法,根据GPV的反向末端重复序列（Inverted Terminal Repeat,ITR）的核苷酸序列设计引物。以此引物和山羊痘皮肤痘疹提取的DNA为模板,建立并优化SYBR GreenI模式荧光PCR检测GPV的ITR基因的方法,并与普通PCR方法进行敏感性比较。结果表明,此次建立的检测GPV的SYBR Green I荧光PCR方法能检测出7×10^2拷贝数的DNA模板,此法比文献报道的普通PCR法更敏感、准确、快速。     

一株猪细小病毒的分离与鉴定

取疑似猪细小病毒(PPV)流产胎儿组织病料,处理后接种PK-15传代细胞,2~4 d后出现了明显的细胞病变;荧光抗体试验结果显示,PPV呈现阳性;以猪细小病毒VP2基因的1对特异性引物,从PPV疫苗、流产胎儿病料及感染细胞培养物中PCR扩增出158 bp的DNA条带;扩增产物经EcoRⅠ酶切分析,得到了预期的条带(123 bp和35 bp),从而证实PCR方法的特异性;敏感性试验结果显示,PCR的最小检出量为300 pg。研究结果表明,2006年9月发生在贵州省某种猪场的疫情确由猪细小病毒感染所致。     

基于N基因的小反刍兽疫病毒贵州流行株分子特征与分群研究

为探讨小反刍兽疫病毒（peste des petits ruminants virus,PPRV）贵州流行株N基因分子特征和分群,试验设计了1对特异性引物,应用RT-PCR技术对小反刍兽疫（peste des petits ruminants,PPR）临床样本进行N基因扩增,克隆至pMD19-T载体,对阳性重组质粒进行测序,应用DANStar软件对测序序列和参考序列进行核苷酸同源性、氨基酸同源性、变异位点及系统进化树分析。结果显示：PPRV贵州流行株N基因扩增长度为1 578 bp,其相互间核苷酸、氨基酸同源性分别为99.6%~100.0%及99.2%~100.0%,与国内参考株N基因的核苷酸序列（97.7%~99.9%）及氨基酸序列（98.3%~100.0%）同源性较国外参考株（88.5%~97.7%和92.2%~98.5%）高;PPRV贵州流行株N基因编码的氨基酸同疫苗株Nigeria 75-1相比存在26个位点突变,但没有氨基酸的缺失或增加;基于N基因系统进化分析显示,PPRV贵州流行株同国内参考株处于同一个进化分支,但与国外参考株处于不同进化分支;其属于病毒进化的Ⅳ基因群,与国内参考株处于同一系统分群,但与疫苗株Nigeria 75-1（Ⅰ基因群）处于不同基因群。     

禽腺病毒血清4型贵州株全基因序列分析

为了解禽腺病毒血清4型（FAdV-4）地方流行毒株的分子进化情况,基于实验室分离的2株FAdV-4贵州株GZ-BJ株和GZ-QL株,分别对2株FAdV-4毒株进行PCR分段扩增,扩增产物克隆至载体,提取质粒进行PCR和双酶切鉴定后筛选出重组质粒进行测序,将测序结果依次拼接得到病毒的全基因组,获得FAdV-4贵州株的全基因序列,并对其进行序列和遗传进化分析。结果显示,通过PCR分段扩增成功获得了2株FAdV-4贵州株（GZ-BJ株和GZ-QL株）的全基因序列,长度分别为43 352、43 723 bp,FAdV-4 GZ-BJ株全基因序列长度比FAdV-4 GZ-QL株短371 bp,少6个ORF（22K、putative 9.1 ku、u-exon、ORF17、ORF28、ORF42）,二者的氨基酸同源性为57.1%。2株FAdV-4贵州株同国内外不同地区FAdV-4毒株核苷酸同源性在88.7%~100%,与FAdV-4经典毒株ON1比对,2株FAdV-4贵州株和国内FAdV-4分离株均缺失ORF19、ORF27、ORF30。系统进化树分析显示,2株FAdV-4贵州株GZ-BJ株和GZ-QL株仍属于Ⅰ群C种FAdV。研究结果表明,2株贵州株FAdV-4 GZ-BJ株和FAdV-4 GZ-QL株较国内外FAdV-4毒株均存在进化与突变,且FAdV-4 GZ-BJ株变化较大,但尚未改变其血清型,这为探索FAdV-4致病机理的分子机制研究提供依据。     

山羊痘病毒基因组DNA的提取及酶切分析

对山羊痘病毒贵州分离株（LD株和QL株）和参考株（Y株和B株）,采用Vero细胞增殖和差速离心浓缩后,以SDS-蛋白酶K法提取病毒基因组DNA,以3种核酸内切酶EcoRⅠ、HindⅢ和PstⅠ进行酶切图谱分析。接种山羊痘病毒48h～60h后,Vero细胞呈现典型的细胞病变;病毒基因组提取样本的纯度在1．8～1．9之间,经琼脂糖凝胶电泳均出现一条纯净的DNA条带;经3种内切酶酶切后,贵州分离株的酶切图谱与参考疫苗毒株Y株基本一致,比参考弱毒株B株少3条～4条酶切片段。这为山羊痘病毒毒力基因的进一步研究奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征的血清学调查与病原核酸检测

为了解贵州省猪群中猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的流行情况,并对临床发生的疑似PRRS疫情作出确定性诊断,本试验采用PRRS酶联免疫诊断试剂盒对非免疫猪群和免疫猪群的1 254头份血清样本进行抗体检测,采用RT-PCR方法对疑似病例样本进行鉴定。结果显示,非免疫健康猪群PRRS抗体阳性率为5.90%;发病猪群阳性率为29.16%;免疫猪群抗体阳性率为59.45%;利用针对PRRSV GP5基因的引物对疑似病例样本进行了PCR扩增,将所得序列与GenBank收录的7株PRRSV GP5基因的核苷酸及氨基酸序列比较分析,结果与欧洲株(LV)的同源性分别为50.0%和46.7%,与美洲株(VR2332)的同源性分别为88.7%和89.9%,而与国内其它毒株的同源性为93.9%~99.1%和91.5%~99.5%;系统进化分析显示贵州分离株均为美洲型。PRRSV Nsp2变异毒株特异性PCR诊断试剂盒鉴定结果显示,疑似病例样本均扩增出特异性条带,表明流行在贵州省猪群中的PRRSV毒株均为变异毒株。     

丝状支原体山羊亚种LPPA蛋白原核表达及间接ELISA方法的建立

【目的】建立基于丝状支原体山羊亚种(Mmc)膜脂蛋白LPPA的间接ELISA方法。【方法】扩增Mmc LPPA基因并将其克隆至pCold-Ⅰ载体,构建重组质粒pCold-Ⅰ-LPPA,测序鉴定正确后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经IPTG诱导表达后纯化得到Mmc LPPA重组蛋白,采用SDS-PAGE验证该重组蛋白是否表达,并采用Western blotting和传统经典的琼脂扩散血清学试验分析其与Mmc阳性血清的反应原性。以该重组蛋白为包被抗原,建立Mmc重组LPPA蛋白的间接ELISA抗体检测方法,对该方法进行反应条件优化后开展特异性、重复性试验,并将其初步应用于184份山羊血清样本。【结果】通过PCR扩增得到Mmc LPPA基因,成功构建了重组质粒pCold-Ⅰ-LPPA,经诱导表达后得到Mmc LPPA重组蛋白,SDS-PAGE结果显示,获得了大小约23 ku的LPPA重组融合蛋白;琼脂扩散及Western blotting试验证明该蛋白反应原性良好。ELISA方法反应条件优化结果显示,LPPA抗原蛋白的包被浓度为2.0μg/100μL,血清稀释度为1∶300,3%BSA封闭...     

禽腺病毒血清4型贵州流行株分离及其致病性分析

为了解贵州地区禽腺病毒血清4型(FAdV-4)分离株的致病性和生物学特性,本研究对经PCR检测为FAdV-4核酸阳性的肝脏样本应用鸡肝癌细胞(LMH)进行FAdV-4分离培养,通过观察FAdV-4感染细胞病变,并应用PCR、间接免疫荧光试验(IFA)、电镜等技术对分离病毒进行鉴定;然后通过动物感染试验分析分离病毒的致病...