传染性法氏囊病免疫失败原因分析

传染性法氏囊病 (IBD)是由传染性法氏囊病病毒 (IBDV)引起的一种急性、高度接触性传染病。IBD疫苗的使用 ,曾使本病一度得到控制 ,但进入 80年代中期后 ,由于 IBDV变异株和超强毒 (vv IBDV)的出现 ,经常导致免疫失败。虽然各国学者在 IBD疫苗的研究上取得了巨大成就 ,均未能从根本上扭转IBD流行日趋严重的现状 ,这可能与各地本病的流行病学、IBD疫苗本身质量、疫苗毒株的特点、疫苗的选择、鸡群的母源抗体、管理条件等诸多因素紧密相关 ,本文就 IBD免疫失败原因及机制做一探讨。1　 IBDV变异株和 vv IBDV与免疫失败1985年 ,…     

3C样蛋白酶：重要抗PEDV药物的筛选靶标

<正>猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是一种有囊膜的单股正链RNA病毒，属于套式病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)成员。由于冠状病毒的RNA酶缺乏校正功能，PEDV等冠状病毒的基因组易发生变异。2010年末，PEDV变异株所致疫情在我国猪群中暴发以来，该病一直在我国猪群中反复流行，对哺乳仔猪的致死率高达100%。当前，疫苗接种仍然是防控PEDV感染的首选措施。然而，冠状病毒变异速度快、流行株多，导致现有疫苗株对当前流行变异株只起到部分的交叉免疫保护。抗病毒药物对于病毒感染的应急性治疗，特别是对新生仔猪等尚未形成完整免疫系统的动物，在缓解病情进一步恶化中发挥重要作用。在抗病毒药物的设计策略中，靶向病毒的药物可以在不影响宿主细胞的同时有效抑制病毒的复制，并且由于大部分病毒结构简单，病毒蛋白数量相对较少，易设计出特异性抑制病毒蛋白功能的抗病毒药物。     

黄曲霉毒素B1高灵敏定性定量免疫层析检测方法的建立

  目的  真菌毒素可污染农产品和动物源性食品，其中黄曲霉毒素B₁(AFB₁)毒性强、危害大，建立AFB₁快速、高灵敏和便捷的检测方法对于监测相关产品中AFB₁污染水平，保障人和动物健康均具有重要意义。基于侧向层析技术原理，采用竞争模式，优化建立免疫层析检测方法，以实现AFB₁的快速定性检测和定量分析。  方法  通过比较分析不同粒径金颗粒标记抗体效果，优化确定免疫层析各组分材料类型、相关缓冲液配方及最佳使用质量浓度，建立AFB₁高灵敏定性定量免疫层析检测方法。  结果  优化建立的AFB₁免疫层析检测法在实际样本中的定性和定量检测限分别为2.5和0.5 μg·kg?1，灵敏度高、特异性强，与其他常见真菌毒素无交叉反应，加标回收实验结果显示:该方法准确稳定，且对AFB₁天然污染样本的定量检测结果与商品化试剂盒及LC-MS/MS一致性较好。  结论  本研究制备的免疫层析检测法可用于样本中AFB₁污染的快速定性检测与定量分析，适合缺乏实验条件的基层检验检疫机构和农产品加工企业对大量样本进行快速筛查，样本检测结果疑似阳性再采用仪器法进行确认，可降低检测成本，提升检测效率，同时为建立其他病原微生物免疫层析检测方法提供参考。图9表2参26     

牛分枝杆菌Mb0869c抑制外源性细胞凋亡的研究

为探究与人受体相互作用蛋白激酶1 (RIPK1)存在互作的牛分枝杆菌(M. bovis) Mb0869c蛋白对细胞凋亡的作用机制，本研究通过PCR从M. bovis DNA中扩增Mb0869c基因片段后构建重组质粒p MN437-Mb0869c并经PCR和测序鉴定正确后，利用电转化法将重组质粒电转入耻垢分枝杆菌(MS)中，并经western blot鉴定Mb0869c蛋白的表达情况。结果显示，重组菌株中出现约55 ku的特异性条带，表明获得了表达Mb0869c的重组菌MS＿Mb0869c。将MS＿Mb0869c株和对照菌株MS＿Vec分别感染人单核巨噬细胞(THP-1)，通过PI和AnnexinⅤ/FITC染色，经流式细胞仪检测细胞的凋亡情况，结果显示，MS＿Mb0869c感染细胞的凋亡率显著低于MS＿Vec感染组，这表明Mb0869c可以抑制MS诱导的细胞凋亡。将上述获得的Mb0869c基因片段克隆于p LVX-IRES-Puro-3×Flag中，构建的重组质粒经测序鉴定正确后，转染HEK293T细胞中，利用嘌呤霉素筛选表达Mb0869c的细胞并经western blot鉴定。结果显...     

单增李斯特菌感染并调控宿主丙酰辅酶A羧化酶α(PCCA)的研究

为探究单增李斯特菌感染与宿主丙酰辅酶A羧化酶α (PCCA)表达的相互影响机制，本研究将单增李斯特菌野生株(LM-EGD-e)以MOI 200感染He La细胞5 h后，利用q RT-PCR检测感染LM-EGD-e后HeLa细胞中Pcca基因的转录水平变化，结果显示LM-EGD-e感染HeLa细胞中Pcca基因的转录水平无明显变化(log2FC=-0.305)；采用相应试剂盒分别提取感染后的He La细胞蛋白和线粒体蛋白，采用western blot检测PCCA蛋白表达变化，结果显示，LM-EGD-e感染后的HeLa细胞中，以及线粒体中PCCA蛋白表达水平均无显著变化(P>0.05)。PCR扩增Pcca基因后构建p CMV-N-HA-PCCA重组质粒，并经PCR和测序鉴定正确后转染HeLa细胞中过表达PCCA蛋白后，利用q RT-PCR检测HeLa细胞中Pcca基因的转录水平，收集细胞总蛋白采用western blot检测PCCA蛋白表达水平，结果显示，与转染空载体的细胞相比，转染重组质粒的HeLa细胞中Pcca基因的转录水平上调(log2FC=8.454)，且细胞内PCCA蛋白...     

非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

p54蛋白是非洲猪瘟病毒(ASFV)进入宿主细胞的重要结构蛋白，参与病毒的早期感染，具有较强的免疫原性，常作为研制非洲猪瘟(ASF)疫苗和检测方法的重要靶点。为制备ASFV p54蛋白的单克隆抗体(MAb)，本研究通过构建重组质粒p ET28a-p54并经原核表达重组p54蛋白(rp54)，采用镍柱亲和层析方法对rp54纯化后经SDS-PAGE鉴定。结果显示，rp54主要在沉淀中出现17 ku的目的条带，经纯化效果较好。采用纯化的rp54免疫BALB/c小鼠，三免后采用间接ELISA方法测定小鼠血清的抗体效价。选择抗体效价最高的小鼠冲击免疫，3 d后取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，通过间接ELISA筛选稳定分泌p54蛋白MAb的杂交瘤细胞。结果显示，三免后小鼠血清抗体效价最高达1∶256 000，表明该蛋白的免疫原性很好。间接ELISA筛选结果显示，获得了3株稳定分泌p54蛋白MAb的杂交瘤细胞株。分别采用western blot、间接免疫荧光试验(IFA)检测该3株MAb的反应原性，采用间接ELISA检测3株MAb的特异性。Western blot结果显示，3株MAb均在...     

利用CRISPRi技术敲低海分枝杆菌PPE13基因

为研究分枝杆菌PPE13基因在宿主细胞的生物功能，本试验利用成簇的规律间隔的短回文重复序列干扰(clustered regularly interspaced short palindromic repeat interference, CRISPRi)构建海分枝杆菌PPE13诱导型敲低菌株。CRISPRi主要包括表达失活的Cas9蛋白(dead cas9,dCas9)和特异性单向导RNA(single guide RNA,sgRNA),通过形成复合体特异性识别相应DNA序列并抑制目的基因的转录。用无水四环素(anhydrotetracycline, ATC)诱导海分枝杆菌PPE13诱导型敲低菌株，提取细菌RNA,利用定量聚合酶链式反应(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)技术检测dCas9、PPE13基因的表达情况，观察细菌在不同时间D_{600 nm}的变化，分析诱导剂质量浓度和目的基因转录水平之间的关系。使用PPE13敲低菌株感染巨噬细胞并检测胞内菌的存活情况。结果表明，在ATC诱导后，dCas9表达水平显著增...     

单增李斯特菌谷氧还蛋白调控氧化应激相关基因转录的研究

本实验室前期对单增李斯特菌(LM)谷氧还蛋白(Grx)转录组数据进行了分析，在此基础上为了对Grx调控细胞色素氧化酶等应激相关基因(lmo0722、qox A、qox B、gr)的转录及其作用机制研究，本研究将Δgrx与野生株EGD-e经4 mmol/L肼应激后，分别提取总RNA并反转录为cDNA作为模板，利用RT-q PCR检测Grx调控细胞色素氧化酶等应激相关基因转录情况，结果显示，Δgrx与野生株EGD-e相比，grx基因缺失引起qox B、qox A、gr、lmo0722等基因的转录水平显著上调(分别上调30、29、17和5.6倍)。利用李斯特菌穿梭质粒构建携带调控基因启动子序列的gfp报告质粒，电转化至野生株EGD-e和缺失株Δgrx感受态细胞中，获得含GFP的重组报告菌株。将这两种含GFP的重组报告菌液分别加入4 mmol/L肼后检测荧光强度，结果显示，EGD-e携带的GFP荧光数值显著低于缺失株Δgrx (P<0.01)，进一步表明Grx参与调控上述应激相关基因的转录。将扩增的lmo0722、qox A、qox B和gr基因的启动子和Grx、Prf A和GAPDH重...     

两种启动子拯救猪繁殖与呼吸综合征病毒ZJ-JX-2015株效率的比较研究

为比较不同启动子驱动的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)强毒株ZJ-JX-2015感染性克隆拯救的各重组病毒的效率，本研究将ZJ-JX-2015株全基因组引入无义突变位点(C-G，形成Bst B I酶切位点)作为后期鉴定标签并分成4段经PCR扩增后，分别克隆至含CMV启动子的p SMART-BAC载体和含T7启动子的p WSK-29载体中构建感染性克隆质粒p SMART-BAC-CMV-r PRRSV和p WSK-29-T7-r PRRSV，经PCR及测序鉴定正确后将前者分别转染BHK-21和293T细胞；将后者转染BHK-21 (T7)细胞。48 h后收集上述各细胞上清液接种Marc-145细胞并连续传10代。通过观察细胞病变(CPE)，收集不同代次Marc-145细胞上清液经PCR及间接免疫荧光试验(IFA)鉴定拯救的各重组病毒。将拯救的各重组病毒以MOI 0.1接种Marc-145细胞，通过测定不同时间各病毒上清液的病毒效价(TCID50)绘制生长曲线。结果显示，各细胞上清液[BHK-21、293T细胞及BHK-21细胞(T7)]在Marc-145细胞中传至第2代时均出现CPE...     

番茄红素对壬基酚诱导小鼠脾损伤的保护作用及机制研究

探讨番茄红素(lycopene,LYC)对壬基酚(nonylphenol,NP)亚慢性中毒诱导小鼠脾损伤的保护作用及机制。将40只清洁级ICR小鼠随机分为对照组(CON)、中毒组(NPG)、番茄红素对照组(LCG)和番茄红素干预组(LNG)。对照组,每天8:30灌服玉米油0.1 mL,2 h后重复操作;中毒组,每天8:30灌服玉米油0.1 mL,2 h后灌服150 mg·kg^-1壬基酚溶液;番茄红素对照组,每天8:30灌服5 mg·kg^-1番茄红素,2 h后灌服0.1 mL玉米油;番茄红素干预组,每天8:30灌服5 mg·kg^-1番茄红素,2 h后灌服150 mg·kg^-1壬基酚溶液。各组连续进行相应灌胃处理30 d后,记录小鼠体重,颌下静脉采集血样,并对小鼠进行安乐死,剖解后采集小鼠脾称重,分析小鼠日均增重以及脾体系数的组间差异;检查血清中免疫细胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α的变化;检测脾氧化与抗氧化指标MDA、T-AOC、CAT、GSH-Px和SOD的差异变化;检测凋亡通路p53/Bcl-2各蛋白表达的差异。结果表明,与NPG相比,经过LYC干预后NP暴露小鼠日均增重显著升高(P<0.05),血清免疫细胞因子含量和脾抗氧化酶活性显著升高(P<0.05);LYC干预后小鼠脾凋亡通路关键分子Akt、p-Akt和Bcl-2蛋白表达水平显著升高(P<0.05),p53和Bax蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。结果提示,LYC对NP诱导的小鼠脾损伤具有保护作用,这与LYC增强脾抗氧化能力,抑制脾细胞凋亡有关。