一种侵染薇甘菊的中国胜红蓟黄脉病毒DNA-A基因组特征及重组分析

为明确采集自我国广西壮族自治区玉林市博白县的疑似为双生病毒侵染并表现叶片黄脉症状薇甘菊的病原物及其基因组分子特征,利用双生病毒DNA-A通用引物SPG1/SPG2和特异性引物WGJ-F/WGJ-R扩增获得病毒基因组,利用β卫星通用引物检测卫星病毒,使用Vector NTI Advance 11.5.1软件进行序列拼接,运用MEGA 7.0和RDP 3.44软件进行系统发育树的构建和重组分析。结果表明：引起薇甘菊叶片黄脉症状的病原物为中国胜红蓟黄脉病毒（Ageratum yellow vein China virus,AYVCNV）,该分离物命名为AYVCNV_WGJ,GenBank登录号为MK880139,但未扩增得到β卫星。该病毒DNA-A基因组全长为2 755 bp,含有6个开放阅读框。AYVCNV-WGJ分离物与AYVCNV鳢肠Eclipta prostrata分离物（GenBank登录号MN218667）的核苷酸序列同源性最高,为90.1%,其中AC4编码的蛋白变异较大。重组结果分析显示AYVCNV_WGJ分离物是由AYVCNV-Tomato分离物（GenBank登录号KU954388）和1个未知病毒（GenBank登录号EU487047）重组得到,重组区域为其基因组2 046~2 612 bp区域。     

烟草芜菁花叶病毒的ELISA和RT-PCR快速检测技术研究

采用间接ELISA和RT-PCR，建立了烟草芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）快速检测的技术体系。间接ELISA测定结果表明，TuMV多抗按1：3000浓度稀释后，具有较高的检测灵敏度，其检测极限浓度为1：3215；通过改进RNA提取技术，从少量的烟草病叶中提取出高质量总RNA，进行cDNA合成及PCR扩增，得到一条长度约986bp的特异PCR扩增产物，与理论设计的大小一致，可有效地对田间烟株进行快速检测。     

重庆南瓜病毒病病原ELISA 检测及CMV 变异分析

 利用7 种植物病毒的抗体,对采自重庆7 个区县的67 份南瓜病毒病样品进行了抗原直接包被酶联免疫吸附分析（ACP-ELISA）检测。检测结果表明,在这67 份样品中,至少59 份感染了所要检测病毒,其中,感染黄瓜花叶病毒 (Cucumber mosaic virus, CMV)、烟草花叶病毒 (Tobacco mosaic virus,TMV)、番茄花叶病毒 (Tomato mosaic virus, ToMV)、芜菁花叶病毒 (Turnip mosaic virus, TuMV)、蚕豆萎蔫病毒2 号 (Broad bean wilt virus 2, BBWV-2)、马铃薯Y 病毒 (Potato virus Y, PVY)和马铃薯X 病毒(Potato virus X, PVX) 的样品分别为80.60%、77.61%、74.63%、82.09%、76.12%、83.58%和55.22%。在检测呈阳性的59 份样品中有93.22%的样品受到2 种以上病毒的复合侵染,而受7 种病毒复合侵染的样品高达60.00%,表明在南瓜上病毒复合侵染现象相当严重。进一步对54 份受CMV 侵染的南瓜样品检测发现,CMV 亚组Ⅰ (CMVⅠ) 病毒侵染的样品有49 份,占90.74%,CMV 亚组Ⅱ (CMVⅡ) 病毒侵染的样品为11 份,占20.37%;其中6 份（11.11%）样品检测到CMVⅠ和CMVⅡ的复合侵染。以免疫捕获反转录PCR (IC-RT-PCR) 扩增了一个CMVⅠ分离物 (CMV-CQ) 近全长CP 基因并进行序列分析,结果证实其属于CMV 亚组Ⅰ型,其核苷酸序列与国内CMVⅠ型赤豆分离物 (CMV-RB) 的同源性最高,为98.1%。     

《植物病毒学》教学改革的探索与实践

提高教学质量,培养具有综合素质的、能适应社会的高学历人才是我国高等教育改革发展的目标。近年来,笔者尝试在植物病毒学课程的课堂教学、实验实践及学生的课后学习等多个教学环节中充分发挥学生的能动性,多渠道激发学生的学习热情,并利用多种现代科学技术,在提高教学质量的同时,使学生综合素质也得以全面培养和提高。     

分离自陕西泾阳番茄的番茄黄化曲叶病毒(TYLCD)的分子特征

从陕西泾阳地区的番茄(Lycopersicon esculentum)上采集到73份表现矮化、黄化和曲叶症状的番茄黄化曲叶病(Tomato yellow leaf curl disease,TYLCD)样品,利用双生病毒简并引物PA和PB及番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)的通用引物TYT-F和TYT-R进行PCR扩增,共有70个样品检测呈阳性;利用双生病毒DNA-B及卫星DNA的通用引物,未扩增到相应目标条带;随机选取样品SX8,利用滚环扩增PCR(RCA-PCR)、克隆及测序等技术获得病毒DNA-A的全基因组序列,该DNA分子全长含2781bp(GenBank登录号:JN412854),与来自山东番茄的TYLCV分离物SD2(缩写为TYLCV-[SD2])(GenBank登录号:GU199587)的核苷酸序列相似性最高,为99.9%;系统进化分析发现,该病毒分离物与我国已报道的TYLCV各分离物亲缘关系较近。这些结果表明,陕西番茄黄化曲叶病是由TYLCV引起,该病毒可能来源于我国山东番茄上的TYLCV。     

基于模板快速制备建立的PVY检测技术

针对发生在烟草上的马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY),建立快速、准确且成本低的检测方法。本试验以烟草粗提液和浸提液为反应模板,以硝酸纤维素(nitrocellulose,NC)膜和聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜为吸附膜,结合RT-PCR检测PVY,通过比较粗提液和浸提液的检出率、NC膜和PVDF膜的检出率,最终建立了以浸提液为反应模板,PVDF膜为吸附膜的浸提液RT-PCR检测方法。该方法检出率与以感病叶片总RNA为模板的检出率一致,耗时更短,成本更低,适用于PVY快速检测。     

普通烟草铁氧还蛋白I的原核表达、抗体制备及在ToMV侵染烟草体内表达分析

【目的】构建普通烟草铁氧还蛋白I(ferredoxin I,Fdn-I)原核表达载体,表达可溶性Fdn-I蛋白,并制备其多克隆抗体,分析Fdn-I在ToMV侵染烟草叶片内的表达情况。【方法】以Fdn-I全长cDNA为模板,用PCR扩增Fdn-I,克隆至原核表达载体pEGX-6p-1,构建Fdn-I与GST融合表达载体pEGX-Fdn-I,重组质粒转化原核表达菌株BL21,优化GST-Fdn-I可溶性表达条件后大量表达蛋白,用GST亲和层析法纯化获得可溶性GST-Fdn-I蛋白,免疫家兔制备多克隆抗体。ELISA测定抗体效价,Western印迹法检测抗体的特异性和ToMV侵染前后烟草叶片内Fdn-I的表达情况。【结果】在温度为28℃,IPTG诱导浓度为0.3 mmol?L-1条件下表达出大小为41.3 kD的可溶性融合蛋白。纯化获得约4 mg可溶性蛋白,免疫家兔制备了效价为1/6 400的多克隆抗体。Western印迹结果表明,该抗体可以与Fdn-I的原核和酵母表达产物特异性结合。分析表明Fdn-I在ToMV侵染后烟草叶片内含量明显低于其在健康烟草叶片内的含量。【结论】通过Fdn-I大肠杆菌中的可溶性表达,制备获得了其高效价特异性多克隆抗体,利用该抗体检测表明ToMV侵染烟草降低了Fdn-I的表达。     

番茄SlN-like的克隆、表达与抗病毒功能

【目的】番茄(Solanum lycopersicum)作为重要的蔬菜作物,其生长受到包括害虫、真菌、细菌和病毒等各种生物因素的危害。明确番茄抗性基因SlN-like的抗病毒功能与机制,为番茄的抗病毒育种与抗病毒药剂的靶向开发提供理论依据。【方法】从茄科植物基因组数据库Solanaceae Genomics Network中获得SlN-like的全长,并将其分为4段,利用融合聚合酶链式反应(fusion PCR)扩增获得SlN-like的序列全长;通过生物信息学分析SlN-like的进化关系、蛋白特征、保守结构域、亚细胞定位以及互作关系;通过实时荧光定量PCR分析SlN-like在番茄根、茎、叶、花和果实中的表达情况及其在烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)侵染后的叶片表达量;借助烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus,TRV)介导的基因沉默技术(virus induced gene silencing,VIGS)沉默番茄内源SlN-like,摩擦接种TMV-GFP于沉默植株,明确SlN-like对病毒侵染的影响。实时荧光定量PCR分析沉默植...     

两种根癌土壤杆菌介导的荧光素酶在植物体内表达分析

根据报道的荧光素酶(Luciferase,Luc)基因设计引物,PCR扩增获得Luc基因,经BamH I和Pst I酶切连接到栽体pCHF3上,成功构建植物表达栽体pCHF3-Luc.将pCHF3-Luc分别转入根癌土壤杆菌株EHAl05和LBA4404细胞内,利用根癌土壤杆菌渗入法导入本氏烟和大麦,荧光检测仪内检测本氏烟和大麦叶片中瞬时表达的Luc活性.结果表明:两种根癌土壤杆菌介导的Luc可以在本氏烟中成功表达,而在大麦中不能表达;利用根癌土壤杆菌渗入法在本氏烟中表达外源基因时,EHA105菌株优于LBA4404菌株.     

烟草5种杀菌剂致害浓度及药害症状分析

[目的]明确5种杀菌剂在烟草上造成药害的最低浓度和药害症状。[方法]通过在推荐用量的基础上设置推荐剂量的多个倍数的浓度梯度,研究了5种杀菌剂在当前烟草主栽品种（云烟87）上造成药害的最低浓度和药害症状。[结果]40％菌核净可湿性粉剂在正常用量3倍时就出现药害症状,而25％溴菌·多菌灵可湿性粉剂、3％多抗霉素水剂、8％宁南霉素水剂、东旺黑达4种杀菌剂在正常用量3倍时不出现症状或症状不明显,而达到6倍时都出现不同的药害症状,用清水处理发生药害的烟草对药害的治理有一定差异。[结论]为准确快速地认识和识别几种烟草药害、最低限度地降低烟草药害对烟草生产造成的损失提供了参考。