柑橘R2R3-MYB类转录因子CitMYB20的克隆与表达分析

为解析柑橘R2R3-MYB转录因子家族成员CitMYB20基因的分子生物学特征及受柑橘黄龙病病菌和溃疡病病菌的诱导表达情况。本研究同源克隆了不同柑橘品种中CitMYB20基因的开放阅读框序列,利用生物信息学方法预测其生物学功能并分析比较该基因在不同品种间的序列差异。在洋葱表皮细胞中瞬时表达观察CitMYB20的亚细胞定位。利用qRT-PCR技术分析黄龙病病菌胁迫和溃疡病病菌胁迫时CitMYB20的表达量变化。研究结果显示柑橘CitMYB20基因在晚锦橙、酸柚、纽荷尔脐橙和四季橘中的相似度达到99.01%,高度保守。晚锦橙中该基因含有3个外显子和2个内含子,其开放阅读框为804 bp,编码267个氨基酸残基。CitMYB20蛋白的N端高度保守,具有两个R结构域,属于典型的R2R3类型的MYB转录因子家族的成员。洋葱表皮细胞亚细胞定位分析结果表明该基因定位于细胞核中。CitMYB20基因受黄龙病病菌胁迫时,在黄龙病敏感品种晚锦橙和耐性品种酸柚中均显著上调表达,其中在耐病品种酸柚中上调表达24倍,在感病品种晚锦橙中上调表达34倍;而在溃疡病病菌胁迫时,CitMYB20基因仅在溃疡病抗性品种四季橘中显著差异表达,感病后上调表达3倍。推测该基因对黄龙病和溃疡病的应答差异可能是因为不同的调控机制造成的,构建CitMYB20基因过表达载体拟对不同病原的应答情况进行深入研究。     

柑橘转基因成分多重PCR检测体系的建立

[目的]建立柑橘转基因成分的多重PCR检测体系。[方法]根据GenBank中pBI121质粒序列和柑橘(Citrus.)Actin基因序列,分别设计CaMV35S启动子、NOS启动子、NOS终止子特异引物和Actin基因的特异引物,建立能同时检测出4种序列的多重PCR检测体系,同时通过正交试验确定该体系的最佳引物浓度和比例及PCR反应体系中各因素的浓度及反应程序,并对该方法的灵敏度进行验证。[结果]试验得到的最佳MPCR反应体系为:10×buffer 2.5μl,25 mmol/L MgCl22.0μl;dNTP Mixture(2.5 mmol/L each)2.0μl,10μmol/L的Actin基因、35S启动子、NOS启动子、NOS终止子引物分别加入1.0、1.0、1.5、0.5μl,模板DNA 0.1μg,Taq DNA聚合酶1.25U,加ddH2O至25μl。PCR反应程序为:94℃预变性5 min;94℃30 s,64.1℃45 s,72℃50 s,31个循环;72℃10 min。试验中,经正交优化后的4重PCR反应灵敏度达0.1%。[结论]该研究建立的MPCR检测体系,理论上已能满足柑橘或其深加工产品的转基因成分检测。     

柑橘溃疡病抗性相关转录因子CitMYB20的功能

【目的】了解柑橘不同品种CitMYB20对柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)和外源植物激素的应答情况,评价转基因植株对柑橘溃疡病的抗性,验证CitMYB20的生物学功能。【方法】根据柑橘基因组序列设计引物,PCR法同源克隆柑橘溃疡病抗性品种金弹金柑(Fortunella japonica)和敏感品种枣阳小叶枳(Poncirus trifoliata)的CitMYB20基因序列和启动子序列,利用在线软件PlantCARE对启动子序列进行顺式作用元件预测。以针刺法对金弹金柑和枣阳小叶枳离体叶片接种柑橘溃疡病菌,用外源激素水杨酸、茉莉酸甲酯和乙烯利处理金弹金柑和枣阳小叶枳的叶片,在处理的不同时期收集材料,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测CitMYB20的表达水平。分别构建CitMYB20的过表达载体和抑制表达载体,根癌农杆菌法转化枳上胚轴,随机摘取转基因株系成熟叶片进行柑橘溃疡病离体抗性评价。【结果】金弹金柑和枣阳小叶枳中CitMYB20(GenBank登录号分别为MN689609和MN689608)序列高度保守,相似度达到99%...     

植物胼胝质合成酶研究进展

胼胝质是一种β-1,3–葡萄糖聚合物,植物在生长发育和受到生物、非生物胁迫过程中均会有胼胝质沉积。胼胝质合成酶又称β-1,3–葡聚糖合成酶类似物,通常以多亚基复合物形式控制胼胝质的合成。本文中对胼胝质合成酶的分离鉴定过程进行了梳理,对胼胝质合成酶复合物的亚基及其作用进行了描述,重点总结了转录因子、植物生长调节剂等对胼胝质合成酶基因表达的调控作用,并对胼胝质合成酶在花粉发育和韧皮部运输过程中的作用,对机械损伤、磷酸盐、金属离子等非生物胁迫,以及虫害、细菌和真菌等生物胁迫的应答反应进行了归纳;最后对胼胝质合成酶的研究方向提出展望,以期为解析胼胝质合成酶的调控机制提供参考,也为植物(特别是园艺植物)抗性基因的挖掘提供借鉴。     

柑橘CsNCED3-2的克隆及其响应溃疡病菌侵染的表达分析

柑橘溃疡病是世界柑橘的一种重要病害,对柑橘产业造成严重的经济损失。对柑橘中9–顺式–环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)基因家族进行注释,并克隆出受柑橘溃疡病菌诱导表达的CsNCED3-2,确定了其表达模式。从柑橘全基因组公共数据库共注释出14个NCED基因家族成员,根据系统发育树和功能结构域将其分为4个亚类;CsNCED3-2其序列全长2 377 bp,开放阅读框1 830 bp,编码609个氨基酸,属于RPE65超家族成员和类胡萝卜素双加氧酶家族成员,是非分泌性蛋白;在‘晚锦橙’和‘金弹’叶片注射溃疡病菌后的各个时间点,‘晚锦橙’叶片中CsNCED3-2的相对表达量总体高于‘金弹’,并且两品种的相对表达变化呈相反趋势;与茎、叶和种子相比,CsNCED3-2在两品种果皮中表达量较高;两品种的CsN CED3-2上游启动子均含有参与植物激素和逆境应答相关的顺式作用元件ABRE(脱落酸响应)、TCA-element(水杨酸响应)、MYC/MYB(干旱响应)等,但数量和类型存在差异。     

柑橘抗溃疡病转录因子CsAP2-09互作蛋白筛选与分析

以前期获得的柑橘抗溃疡病的正调控转录因子基因CsAP2-09超表达植株为材料,利用GST融合蛋白沉降技术(GST pull-down)联合液相色谱串联质谱(LC–MS/MS)方法筛选并鉴定CsAP2-09的互作蛋白。首先原核表达并纯化GST-CsAP2-09作为诱饵蛋白,然后与CsAP2-09超表达植株叶片总蛋白孵育、洗脱后进行SDS-PAGE验证,最后进行LC–MS/MS鉴定。得到17个互作蛋白,将蛋白进行注释、GO分析、KEGG分析,发现其中5个可能与植物抗病相关(如过氧化氢酶Cs3g27280)。构建这17个蛋白的互作网络,其中14个蛋白的互作关系得到已有数据的支持。对CsAP2-09与互作蛋白的共表达分析发现CsAP2-09超表达引起了16个蛋白表达上调和1个蛋白表达下调。     

枳根cDNA全长文库的构建与分析

为了解柑橘优良砧木枳（Poncirus trifoliata）根部的基因表达信息,利用SMART技术构建了枳的根组织全长cDNA文库。检测结果显示所建枳根原始文库的容量为1.08 × 106 cfu ? mL-1,扩增后文库容量为1.30 × 109 cfu ? mL-1,重组率为95%。通过文库随机测序获得182个长度大于100 bp的ESTs序列（GenBank登录号为JK316116 ~ JK316297）,序列拼接后得到96个Unigenes,包括12个Contigs和84个singletons。其中,68个Unigenes可与GenBank中登录的基因相匹配,56个与已知的柑橘基因相匹配,36个为全长基因。对24个全长基因完成了功能注释,并进一步开展了生物信息学分析,发现有6个应激反应基因和3个根发育相关基因。     

柑橘转基因成分多重PCR检测体系的建立(英文)

[目的]建立柑橘转基因成分的多重 PCR 检测体系。[方法]根据 GenBank 中 pBI121 质粒序列和柑橘(Citrus.)Actin 基因序列,分别设计CaMV35S 启动子、NOS 启动子、NOS 终止子特异引物和 Actin 基因的特异引物,建立能同时检测出 4 种序列的多重 PCR 检测体系,同时通过正交试验确定该体系的最佳引物浓度和比例及 PCR 反应体系中各因素的浓度及反应程序,并对该方法的灵敏度进行验证。[结果]试验得到的最佳MPCR 反应体系为:10×buffer 2.5 μl,25 mmol/L MgCl22.0 μl;dNTP Mixture (2.5 mmol/L each)2.0 μl,10 μmol/L 的 Actin 基因、35S 启动子、NOS 启动子、NOS 终止子引物分别加入 1.0、1.0、1.5、0.5 μl,模板 DNA 0.1 μg,Taq DNA 聚合酶 1.25 U,加 ddH2O 至 25 μl。PCR 反应程序为:94 ℃预变性5 min;94 ℃ 30 s,64.1 ℃ 45 s,72 ℃ 50 s,31个循环;72 ℃ 10 min。试验中,经正交优化后的4重PCR反应灵敏度达0.1%。[结论]该研究建立的MPCR检测体系,理论上已能满足柑橘或其深加工产品的转基因成分检测。     

柚类种质资源表型多样性分析及综合评价

为了建立合理的柚类分类系统并为柚类育种提供参考,本研究以82份柚类种质资源为试材,采用变异系数、Shannon-Weaver多样性指数、方差、相关性、主成分、聚类、回归分析等对其26个表型性状进行多样性分析、差异分析及综合评价。结果表明:这82个品种的26个性状的变异系数为0.26%。其中翼叶面积和果心面积变异较大,其他性状遗传特性较稳定;单果重、果横径、果形指数、果皮厚、囊瓣数、种子数、果心长和宽、叶片长和宽、叶片面积、花瓣宽、花柄长等性状等级分布均匀,翼叶面积、花瓣数、雄蕊长分级较少且分布不均;来源于中国大陆以外品种的果皮厚、叶柄长、翼叶长,明显优于长江流域和珠江流域来源的材料,但雌蕊长则相反;选育品种的叶片长、宽和面积显著大于遗传材料和地方品种;82个品种可聚为大翼叶大果型、大翼叶小果型,小翼叶大果型,小翼叶小果型4个类群;前7个主成分累计贡献率75.57%,包含了柚类表型性状的大部分信息;26个性状F平均值0.45,其中早暹柚得分最高为0.69,红肉琯溪蜜柚最低为0.24;囊瓣数、种子数等12个性状与F值极显著相关;回归方程筛选出单果重、囊瓣数等19个性状。本研究说明柚类种质资源具有较高的表型多样性,筛选出的19个性状可作为柚类综合评价指标,为柚类育种提供科学依据。     

转基因柑橘外源基因拷贝数的实时荧光定量PCR检测

为分析转基因柑橘中外源基因整合拷贝数,基于实时荧光定量PCR法,建立通用、准确、简便的转基因柑橘外源基因拷贝数检测体系,利用该体系成功检测了150个转基因柑橘单株系外源基因整合拷贝数。结果表明,转基因柑橘中外源基因整合最低拷贝数为1,最高达5个,其中1、2和 ≥ 3拷贝的单株数分别占总数的40.0%、18.0%和42.0%;采用Southern blot技术进行检测,结果基本一致,极少数单株经实时荧光定量PCR分析的拷贝数比Southern blot检测的数值高。说明本研究建立的实时荧光定量PCR方法检测转基因柑橘外源基因整合拷贝数更加准确可靠。拷贝数为1 ~ 2的转基因株系可作为将来开展转基因目标性状研究及转基因生物安全性评价有利用价值的试验材料。