猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)对猪小肠黏膜上皮细胞活性的影响

观察猪传染性胃肠炎病毒对猪小肠黏膜上皮细胞Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性,细胞增殖和凋亡的影响。将猪传染性胃肠炎病毒接种于体外培养猪小肠黏膜上皮细胞24、48和72 h后,检测细胞的ATP酶(Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶)活性,MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞仪测定细胞周期,PI染色法检测细胞凋亡。与空白组相比较,试验组小肠黏膜上皮细胞的Na+-K+-ATP酶活性降低(P<0.05),Ca2+-Mg2+-ATP酶活性降低(P>0.05),细胞增殖能力降低,S期细胞比例降低,细胞凋亡明显。猪传染性胃肠炎病毒可以降低猪小肠黏膜上皮细胞的Na+-K+-ATP酶活性、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性,减弱细胞的增殖能力并引起细胞凋亡。     

不同佐剂对猪传染性胃肠炎病毒S蛋白和猪流行性腹泻病毒S蛋白免疫原性的影响

本研究旨在探究不同佐剂对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白和猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白免疫原性的影响。IPGT诱导重组表达菌株Rosetta(DE3)-pET28a-TGEV-S2/3和BL21(DE3)-pET28a-PEDV-S1/2/3,制备重组蛋白TGEV-S2、TGEV-S3、PEDV-S1、PEDV-S2和PEDV-S3,并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定,将重组蛋白等量混匀分别与3种佐剂ISA 71VG、ISA 201VG和ISA 15AVG进行乳化制备免疫原免疫蛋鸡;Western blot检测蛋鸡血清抗体效价,免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)检测抗体与病原的反应活性;监测鸡群平均日增重。结果显示,重组蛋白TGEV-S2、TGEV-S3、PEDV-S1、PEDV-S2和PEDV-S3的分子量依次为25 ku、28 ku、26 ku、24 ku和21 ku。Western blot分析显示,5种蛋白均具有良好的免疫原性;疫苗二次免疫后7天抗体效价达到高峰,ISA 201VG佐剂组、ISA 71VG佐剂和ISA 15AVG佐剂组组最高抗体效价依次为64000倍、32000倍和8000倍,对照组未检测到特异性抗体;ISA 71VG和ISA 201VG组对产蛋率下降相对较大,ISA15AVG 佐剂疫苗免疫组对产蛋率影响相对较小,免疫后7天后试验组产蛋率恢复正常。ISA 71VG佐剂组蛋鸡平均日增重显著降低,ISA 201VG和ISA 15AVG佐剂组蛋鸡平均日增重与对照组无显著差异;ISA 201VG佐剂组血清抗体与病毒反应活性良好,中和效价可达1:256。ISA 201VG佐剂配伍的疫苗免疫效果优于其他两种佐剂疫苗。     

1株猪传染性胃肠炎病毒的分离鉴定及其生物学特性研究

采集1例疑似感染猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)仔猪的粪便,运用RT-PCR方法和血清学方法对病料进行TGEV检测,并应用猪睾丸细胞(ST)进行病毒分离培养,分别采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)和RT-PCR方法检测病毒在ST细胞中的增殖动态,应用RT-PCR方法扩增分离TGEV S1基因,经序列测定后,采用DNAStar 7.0和Mega 5.0软件对TGEV进行生物信息学分析。结果表明,病料接种到ST细胞培养后,出现明显细胞病变效应(CPE);RT-PCR检测结果显示,TGEV核酸阳性;血清学鉴定TGEV抗原阳性。将分离毒株命名为TGEV-NY。感染12 h后,IPMA检测结果阳性,且可从细胞培养上清中检出TGEV核酸。序列测定分析表明,分离毒株S1基因开放阅读框(ORF)为2 220 bp,编码740个氨基酸。进化分析显示,分离毒株与我国2006年分离的SC-Y毒株亲缘关系最近,分离毒株属于基因Ⅰ群。     

猪流行性腹泻病毒CH-HuN1301株N基因重组表达载体的构建及稳定表达细胞系的建立

本研究旨在建立猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV） CH-HuN1301株N蛋白稳定表达细胞系。采用RT-PCR扩增PEDV新流行毒株CH-HuN1301株N基因,分别克隆至原核表达载体pET28a和真核表达载体pEGFP-C1构建重组表达载体,所测定的序列采用Mega 5.0软件进行进化分析。将原核表达的N蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,重组真核表达载体pEGFP-PEDV-N转染HEK293细胞,经用G418筛选获得稳定的表达细胞系。荧光倒置显微镜观察细胞荧光,免疫过氧化物酶单层细胞染色法（IPMA）检测N蛋白的表达。结果表明,PEDV HuN1301-14毒株N基因大小为1 323 bp,原核表达重组N蛋白分子质量约60 ku,其多克隆抗体与PEDV呈特异性反应,荧光倒置显微镜观察和IPMA检测结果显示N蛋白在HEK293细胞中稳定表达。该细胞系的建立为进一步研究PEDV的诊断方法提供了基础材料。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白与猪O型口蹄疫病毒VP1蛋白在杆状病毒中共表达及鉴定

为在真核细胞中共表达猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白与猪O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1蛋白,本研究将其各自编码基因克隆于杆状病毒双表达载体(pFastBacTMDual)中构建重组转移质粒(pFBD-Cap-VP1),转化至DH10BacTM感受态细胞中制备重组杆粒(rBacmid-Cap-VP1),并转染Sf21昆虫细胞,拯救出能够共表达PCV2-Cap和FMDV-VP1蛋白的重组杆状病毒(rBac-Cap-VP1)。SDS-PAGE和western blot检测结果表明,共表达的重组PCV2-Cap和FMDV-VP1蛋白产物的分子量分别为28 ku和30 ku,各占总蛋白含量的11.6%和3.4%,能够分别与PCV2和FMDV抗体发生特异性反应,表明共表达蛋白具有良好的反应原性。本研究为PCV2和FMDV基因工程二联亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

一例犬瘟热的诊疗报告

对一例疑似犬瘟热(CD)的病例进行诊断及治疗,分别采用胶体金试纸条检测、采用逆转录-聚合酶链式反应(R T-PCR)检测病原抗原和犬瘟热病毒(CDV)N基因序列分析。结果显示,病犬鼻分泌物经胶体金检测为CDV抗原弱阳性,RT-PCR产物大小为287 bp,此毒株N基因核苷酸序列与野毒株的核苷酸序列同源性高达96.5%~98.6%,遗传进化分析显示,该毒株与疫苗株(Onderstepoort、CDV3等)和Lederle等弱毒株不在同一分支上,而与野毒株在同一分支,说明该毒株为CDV强毒株,将此分离株命名为CDV-Hu NHY171124。采用中西结合的抗病毒治疗方案对病犬进行为期7 d的治疗,疗效不显著,病情恶化而接受安乐死。     

一株I型犬腺病毒的分离与鉴定

为给I型犬腺病毒(CAV-I)后续研究提供基础材料,采集疑似犬传染性肝炎患犬粪便,用PCR方法进行CAV-I核酸检测,并运用犬肾传代细胞(MDCK)进行病毒分离培养,采用PCR和免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)检测病毒在细胞内的繁殖状态。结果显示:患犬粪便样品PCR检测为CAV-I核酸阳性,病料接种MDCK细胞培养24 h后出现明显的"葡萄串样"细胞病变效应(CPE);培养物血清学鉴定为CAV抗原阳性,不同代次病毒培养物均为CAV-I核酸强阳性;第9代病毒核酸序列与Gen Bank中CAV-I毒株核苷酸相似性在99.0%以上,与CAV-Ⅱ相似性仅为65.3%;该病毒与CAV-I毒株处于同一遗传分支;病毒接种MDCK后8 h内均无抗原检出,12 h后细胞核中分布大量的CAV抗原,24 h后细胞出现典型的"葡萄串样"病变,抗原在细胞中呈弥散分布。上述结果表明,分离到的毒株为CAV-I,命名为CAV-ZY180711。     

猪Cyclin A和CDK2蛋白对猪细小病毒增殖的调控作用

【目的】探究猪细胞周期素Cyclin A(pCyclinA)及其依赖性激酶2(pCDK2)对猪细小病毒(PPV)增殖的调控作用,为开展PPV复制机制研究提供依据。【方法】采用RT-PCR扩增pCyclinA和pCDK2基因,克隆至真核表达载体pEGFP-C1中构建重组载体,转染猪睾丸细胞(ST),经新霉素(G418)筛选获得pCyclinA或pCDK2过表达的ST细胞株。设计pCyclinA和pCDK2基因特异性干扰片段(shRNA)CycA894和CDK1163,构建干扰表达载体,转染ST细胞,经G418筛选得到pCyclinA和pCDK2低表达的ST细胞株,实时荧光定量PCR检测其干扰效率。流式细胞术分析pCyclinA和pCDK2过表达和低表达对ST细胞周期的影响。将猪细小病毒NY毒株(PPV-NY)接种过表达和低表达的ST细胞,用免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)检测病毒滴度。【结果】pCyclinA和pCDK2基因的开放阅读框(ORF)分别为1 299和897 bp,构建了重组载体pEGFP-pCyclinA和pEGFP-pCDK2。荧光显微镜观察结果显示,融合蛋白EGFP-pCycA和EGFP-pCDK2分别在过表达细胞株ST-pEGFP-pCyclinA和ST-pEGFP-pCDK2中稳定表达。构建了干扰载体pGPU6-GFP/CycA894、pGPU6-GFP/CDK1163和pGPU6-GFP/-shNC(阴性对照);低表达细胞株ST-pGPU6-GFP/CycA894和ST-pGPU6-GFP/CDK1163中的pCyclinA、pCDK2基因的mRNA表达量均极显著降低(P0.01)。pCyclinA或CDK2过表达分别极显著或显著降低ST细胞S期的比例(P0.01或P0.05)。pCyclinA低表达能极显著降低ST细胞G0/G1期的比例(P0.01)、极显著增加S期和G2/M期的细胞比例(P0.01);pCDK2低表达能显著增加ST细胞G0/G1期的比例(P0.05),但却显著降低S期的细胞比例(P0.05)。PPV在过表达细胞株ST-pEGFP-pCyclinA和ST-pEGFP-pCDK2中的滴度均极显著低于对照细胞(P0.01)。低表达细胞ST-pGPU6-GFP/CycA894中PPV滴度极显著增加(P0.01),而ST-pGPU6-GFP/CDK1163中的PPV滴度无显著变化(P0.05)。【结论】pCyclinA或pCDK2过表达均能抑制PPV增殖;pCyclinA低表达可促进PPV增殖,pCDK2低表达对PPV增殖无显著影响;pCyclinA低表达极显著降低G0/G1期细胞比例、但极显著增加S期和G2/M期细胞比例。     

兽医科学的时代内涵与使命

我非常羡慕Calvin Schwabe博士在兽医、公共卫生和医学史上所取得的终生成就和卓越贡献，尤其赞赏他在1984年发表的《兽医与人类健康》中提出的“一种医学”观点，正是这种观点激发我们努力将兽医和人医结合起来以提高世界的公共卫生健康。Marguerite Pappaioanou博士在新世纪也再一次向世人强调了兽医在维护和提高人类的健康水平方面所占据的不可或缺的重要地位。有鉴于此，本文系统地阐述了兽医科学的时代内涵及其所担负的责任与发展方向。