伪狂犬病病毒感染诱导和抑制细胞凋亡

用伪狂犬病病毒 (pseudorabies virus,PRV)鄂 A株感染非免疫健康初生仔猪 ,5 d后出现典型的伪狂犬病临床症状。从感染 PRV鄂 A株仔猪的肾脏、肝脏、扁桃体、胸腺、腹股沟淋巴结、颈部淋巴结等组织细胞提取的 DNA,经琼脂糖凝胶电泳呈现大小不等的 180～ 2 0 0 bp整倍数的寡核苷酸片段梯状条带 ,经 PCR方法鉴定为 PRV DNA。末端脱氧核苷转移酶原位标记 [terminal deoxynucleotidyl transferase(Td T) - conjugated d UTP nick end labelling,TUNEL ]法显示 ,部分凋亡的阳性细胞呈现染色质凝聚、细胞核固缩、染色质靠核膜边聚集等形态学变化 ,说明 PRV诱导细胞凋亡是造成急性感染时组织器官广泛损伤的重要原因之一 ;而 PRV感染的大脑、小脑、嗅球及脊髓等神经系统组织中未观察到上述细胞凋亡特征 ,说明 PRV可以抑制急性感染时神经细胞发生凋亡。本试验结果显示 ,在 PRV急性感染状态下 ,病毒诱导细胞凋亡是杀伤细胞的重要途径之一 ,同时这一过程又可通过神经系统病毒基因隐性感染及潜伏期的建立而受到抑制     

病死动物无害化处理存在的问题及改进措施

病死动物在动物养殖、屠宰加工、运输储藏等环节极易发生和存在,如不能对其进行无害化处理,容易造成动物疫病发生传播和扩散,给畜牧业安全生产和人民生命财产安全构成严重威胁,为此,病死动物无害化处理必须引起社会各界的广泛关注和高度重视,据笔者在基层了解,病死动物无害化处理仍存在一些不容忽视的问题主要表现在：     

光泽县农村散养动物防疫工作存在的问题与做法

分析农村散养动物疫病防控工作存在的问题,介绍光泽县农村散养动物疫病防控工作的做法。     

猪细小病毒SYBR Green I模式实时定量PCR检测方法的建立

根据GenBank猪细小病毒（PPV）的NS1基因序列,设计一对特异性引物,采用SYBRGreenI随机结合渗入法,建立实时定量PCR检测方法,构建了检测PPV的标准DNA模版,循环阈值（Ct）与标准质粒DNA模板在7．8×10^1-7．8×10^8拷贝μl浓度范围内呈良好的线性关系,相关系数为0．997。该方法用于猪细小病毒的检测具有很高的特异性,其敏感性与常规PCR相比可以提高100倍,可以用于猪细小病毒的快速检测。     

猪伪狂犬病病毒双基因缺失突变株(HB-98株)安全性、稳定性和免疫原性测定

对以伪狂犬病病毒鄂A株为亲本毒株构建的TK和gG双基因缺失突变株（PrV HB-98株）的增殖能力、安全性、毒力稳定性和免疫原性进行了测定。结果表明，PrV HB-98株在BHK-21细胞上的增殖滴度为10^7.0 TCID50／0．1mL以上，与亲本毒株相当，但高于Bartha株；与PrV鄂A株相比，病毒量为10^7.0TCID50的PrV HB-98株不引起BALB／c小鼠的死亡，毒力也低于Bartha株；将PrV HB-98株在PK-15细胞连续培养25代和在猪体内上连续继代5次，各代次突变株TK基因和LacZ基因能被稳定扩增，未出现毒力回复现象．表明该毒株具有良好的遗传稳定性；以10^5.0、10^6.0、10^7.0TCID50等3个不同剂量的PrV HB-98株接种于妊娠50～60d母猪和1日龄仔猪，母猪均能正常产仔．仔猪也未出现任何临床症状，证明该毒株有较好的安全性。另外，以10^5.0TCID50的PrV HB-98株接种于妊娠50～60d母猪和1日龄仔猪，分别于接种后28d和20d，用10^7.0TCID50 PrV鄂A强毒进行攻击．结果免疫猪都能抵抗强毒的攻击．获得保护，表明该毒株具有很强的免疫原性。综合上述结果表明，PrV HB-98株可以作为候选毒株．用于伪狂犬病基因工程疫苗的研制。     

乙型脑炎病毒NS1基因重组伪狂犬病毒的构建

设计1对引物从含有乙型脑炎病毒NS1基因的质粒pNS1上亚克隆NS1基因,将NS1基因插入到中间转移载体pUSK中，获得重组中间转移质粒pUSK—NS1。将pUSK—NS1与伪狂犬病毒Ea株TK／gG／LacZ^ 突变株基因组共转染真核细胞IBRS-2，通过空斑纯化得到了乙型脑炎病毒NS1基因重组伪狂犬病毒株TK／gG^-／NS^ 1。经检测,重组病毒能表达具有生物活性的NS1蛋白。该重组病毒可作为猪乙型脑炎和伪狂犬病双价基因工程疫苗用毒株。     

伪狂犬病病毒鄂A株gG^—／LacZ^＋突变株的构建

以从湖北某猪场分离鉴定的鄂A株为亲本，提取其基因组DNA，克隆含gG基因的SphI/KpnI片段，然后将LacZ基因融合到gG启动子下游，得到重组质粒pUSKZ,将重组质粒与鄂A株基因组共转染PK－15细胞，待细胞完全病变后，在X－gal存在下，作蓝斑筛选纯化。经斑点杂交和PCR扩增证实得到的是基因型为gG^-/LacZ^ 的重组伪狂犬病病毒。     

高效液相色谱-电喷雾串联质谱法直接测定蜂蜜中脯氨酸

建立了高效液相色谱一电喷雾串联质谱法直接测定蜂蜜中脯氨酸的方法。蜂蜜样品用去离子水溶解后,过0．45μm水相微孔滤膜,高效液相色谱一电喷雾串联质谱进行分析检测。以Phenomenex C18（100mmx4．6mmx2．6μm）色谱柱为分析柱,乙腈和0．1％（v／v）甲酸-5mmol／L乙酸铵水溶液为流动相进行梯度洗脱,在电喷雾正离子多反应监测模式下进行检测,外标法定量。通过加标验证,该方法检测低限可达25mg／kg,脯氨酸在0．5～10．0μg／mL浓度范围内线性关系良好,相关系数大于0．99。在25、50和100mg/kg三个加标水平下,蜂蜜中脯氨酸平均回收率为83．7～109．6％,相对标准偏差（RSD）为2．4～10．9％。该方法样品处理简单、快速,结果准确,灵敏度高,可以作为日常蜂蜜中脯氨酸的检测方法。     

同胚增殖鸡新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的效果观察及免疫应答反应

鸡新城疫病毒（ＮＤＶ）和鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）混合在同一鸡胚中增殖,当ＮＤＶ和ＩＢＶ接种浓度控制在一定范围时,最佳收毒时间选择使ＮＤＶ有足够时间增殖到最佳滴度,且在这一时间内不至于因孵育时间过长而致ＩＢＶ毒力减弱。结果表明ＮＤＶＬａｓｏｔａ株经１０倍稀释分别与４株ＩＢＶ１０００倍稀释液等体积混合后接种,能在同一鸡胚中正常增殖,即９６ｈ收毒,血凝（ＨＡ）方法测定两种病毒的血凝价均能达到最佳滴度,其血凝价不低于各自单独增殖的滴度。４种ＩＢＶ株与ＮＤＶ同胚增殖的ＨＡ滴度进一步证实,在合适的条件下,ＩＢＶ均不对ＮＤＶ的复制产生干扰作用,４种ＩＢＶ的血凝价无明显差异。免疫试验中用同胚增殖两种病毒二联苗接种,鸡体血清中可产生抗两种病毒的ＨＩ抗体,与各自单独接种时的ＨＩ抗体水平几乎一致。本试验中制备的ＩＢ血凝抗原在４℃保存一个月,其血凝活性保持不变。ＩＢＶ微量血凝抑制（ＨＩ）试验特异性测定结果证实,用自制ＩＢＶ血凝抗原进行ＨＩ试验检测鸡ＩＢ阳性血清均能产生稳定的特异性反应,并且无交叉反应。说明ＨＩ试验是检测ＩＢＶ抗体水平的有效可行的方法。     

间接ELISA检测猪伪狂犬病血清抗体

用猪肾传代细胞IBRS－2增殖猪伪狂犬病病毒（PRV）鄂A株，病毒培养上清液经硫酸铵沉淀、聚乙二醇（Mr20000）浓缩后作为包被抗原。用纯化的猪血清IgG免疫家兔，HRP村记撮的兔抗猪IgG，制备出高效价的酶标抗体，酶标抗体工作浓度为1：50000；经各种条件的选择，建立了检测猪伪狂犬病血清抗体的间接ELISA。所建立的间接ELISA抗原包被浓度为39.2mg/L，血清最佳稀释度为1：20，与猪细小病毒、猪、O型口蹄疫、猪衣原体标准阳性血清呈阴性反应，与标准阴性血清和临床未感染PRV的猪血清呈阴性反应；与猪伪狂犬病标准阳性血清、免疫猪血清和临床发病猪血清呈明显的阳性反应；与美国进口的PRV抗体检测ELISA诊断试剂盒检测结果比较，45份猪血清的阴、阳性检出符合率均为100％。表明建立的间接ELISA具有敏感性高、特异性强、重复性好的优点，可用于猪伪狂犬病血清抗体的定性和定量检测。