施氏鲟下丘脑神经肽基因的克隆、序列分析及表达特征

为了解下丘脑神经肽(kisspeptin)在施氏鲟(Acipenser schrenckii)生殖调控中的作用,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和RACE技术首次克隆得到施氏鲟2个kisspeptin基因的全长cDNA序列,命名为kiss1和kiss2,并对它们编码氨基酸序列的特征及时空表达模式进行分析。结果表明,施氏鲟kiss1基因的cDNA全长为522 bp,编码130个氨基酸;kiss2基因的cDNA全长为518bp,编码149个氨基酸;Kiss1和Kiss2均以α-螺旋和无规则蜷曲为二级结构中的主要元件,且为含有信号肽、无跨膜结构、分泌到细胞外的不稳定亲水性蛋白质。氨基酸序列比对及进化分析表明,施氏鲟Kiss1和Kiss2具有高度保守区域,与达氏鲟(Acipenser dabryanus)Kiss1和Kiss2蛋白序列一致性最高,亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,施氏鲟kiss1和kiss2的表达具有组织特异性,其中kiss1在性腺中的表达量最高,而kiss2在脑中的表达量最高。kiss2在早期性腺发育过程中的表达量检测显示,在孵化后0～49 d, kiss2的表达量较低,而kiss1的表达量则较高,在孵化后21 d达峰值;随着性腺的发育(孵化后64～199 d), kiss2的表达水平逐渐升高并在139 d达到最高,随后下降;与kiss2表达模式不同, kiss1的表达量在孵化后184 d达到峰值。以上结果表明, kisspeptin基因在施氏鲟早期性腺发育过程中具有重要的作用,且其调控功能存在差异。本实验为进一步阐明kiss1和kiss2的生理功能和分子调控机制奠定了理论基础。     

温度对黑斑原(鱼兆)仔鱼生长的影响

将孵出30d、平均体质量0.043g的黑斑原(鱼兆)Glyptosternum maculatum仔鱼常规饲养在4个循环水养殖系统(长1.8m×宽0.6m×高0.6m)中,水温保持在9℃、12℃、15℃和18℃下,每个温度组设置3个平行,研究不同温度对黑斑原(鱼兆)仔鱼生长及存活率的影响。35d的饲养结果表明:随着温度的升高,黑斑原(鱼兆)仔鱼的生长加快,死亡率增加,其中18℃组黑斑原(鱼兆)最早开始死亡,9℃组黑斑原(鱼兆)存活率最高。在整个饲养期间,水温9℃组与12℃组黑斑原(鱼兆)全长和体质量生长最快,死亡率最低,显著高于其他组(P0.05)。因此,9～12℃为黑斑原(鱼兆)仔稚鱼的适宜培育温度。     

鲤四种经济性状的微卫星标记分析

获得与经济性状相关的分子标记或基因是开展该性状分子育种的先决条件。本文利用300个微卫星标记检测了以柏氏鲤和荷包红鲤抗寒品系杂交F2代1个家系、92个个体的基因型,回归分析了其体长、体厚、体高和体重4种经济性状的GLM单标记。Permutation检验结果显示：有23个标记分别与体长、体厚、体高和体重具有显著相关性（P〈0.05）,其中,HLJ44、HLJE28、HLJ1148、HLJ1329、HLJ464与这4种性状极显著相关（P〈0.01）。对同一标记不同基因型之间进行了多重比较,找到了与这4种性状相关的基因型。此研究还发现75个微卫星标记发生了偏分离,其中11个偏分离标记与性状显著相关,偏分离指数分析表明,基因型的偏分离可能与性状的选择压力和选择方式有关。本研究获得的与鲤4种性状相关的标记及基因型,为鲤的分子标记辅助育种（MAS）和生长性状的遗传机制研究提供了有效的依据。     

施氏鲟促卵泡激素受体基因cDNA的克隆、表达及调控

为研究促卵泡激素受体基因(FSHR)在施氏鲟(Acipenser schrenckii)性腺分化过程中的表达、分布及调控作用,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和RACE技术克隆得到施氏鲟促性腺激素(FSHR)基因的全长cDNA序列,并对其编码氨基酸序列的特征、基因表达及调控作用进行了分析。结果显示:施氏鲟FSHR基因的cDNA全长为2696 bp,编码661个氨基酸,属于含有信号肽、跨膜结构且分泌到细胞外的疏水性蛋白。氨基酸同源性及进化分析表明,施氏鲟与小体鲟(A.ruthenus)FSHR序列一致性最高,亲缘关系最近。PCR结果显示,FSHR mRNA的表达具有广泛性,各组织中均有表达,但在性腺、垂体中的表达量较高,显著高于其他组织中的表达量。LHRH-A注射实验显示:不同浓度组中,施氏鲟性腺组织中FSHR mRNA的表达量呈先升高后降低的变化趋势;与对照组相比,1μg/kg组在诱导3 d时性腺组织中FSHR mRNA的表达量达到最高,极显著高于3μg/kg和5μg/kg组。与性腺组织中FSHR mRNA表达模式不同,垂体中FSHR mRNA的表达呈升高后降低趋势,3μg/kg组在注射后第3天达最大值。综上结果表明,LHRH-A可通过调控FSHR的表达参与施氏鲟的早期性腺发育。     

镜鲤脂肪酸延长酶5基因的克隆和表达分析

脂肪酸延长酶5(ELOVL5)是高不饱和脂肪酸(HUFA)合成的关键酶之一。为了研究鲤HUFA合成的能力和机制,本研究采用RT-PCR和RACE技术获得镜鲤ELOVL5全长c DNA序列。ELOVL5基因c DNA全长1 121 bp,开放阅读框为876 bp,编码291个氨基酸。序列分析显示,镜鲤ELOVL5氨基酸序列包含1个组氨酸簇(HXXHH),1个典型的内质网驻留信号,多个跨膜区域和多个保守区域(KXXEXXDT、QXXFLHXYHH、NXXXHXXMYXYY、TXXQXXQ),具有典型的脂肪酸延长酶的结构特征。氨基酸同源性分析结果显示,镜鲤ELOVL5基因与其他鱼类同源性为79.0%~93.1%,与人同源性为69.0%。通过实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测该基因在镜鲤不同组织中的表达量,发现脂肪酸延长酶基因在镜鲤肝中表达量最高,其次为脑,在背部肌肉中表达量最低。镜鲤ELOVL5基因的获得为进一步研究镜鲤HUFA的合成途径及调控机理奠定了基础。     

利用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼ifi30基因

利用CRISPR/Cas9技术,在斑马鱼Danio rerio干扰素γ诱导蛋白30(ifi30)基因的第一个外显子处选取靶位点,用PCR法构建g RNA,并进行体外转录。将体外转录的sg RNA和Cas9m RNA显微注射到斑马鱼1细胞期的受精卵中,实现对靶基因ifi30的沉默。注射后24h检测发现,基因突变率在79%~95%之间,平均突变率为87.2%。为了获得稳定遗传的基因突变纯合系,将F_0代与野生型斑马鱼进行配组,获得了3种突变类型的F_1代,其突变率为30%。三种突变类型中突变1和突变2为移码突变,突变3删除了6个碱基,并未造成移码。突变1和突变2的F_1代杂合个体生长发育未见异常。将杂合F_1代自交,理论上将获得突变纯合个体,但仅在受精2h以内的胚胎中检测到了突变纯合个体,受精24h后的胚胎中,只有野生型和杂合型,未见突变纯合个体。推测ifi30基因的移码突变造成了干扰素γ诱导蛋白的缺失,导致胚胎死亡。     

镜鲤肌肉品质性状的微卫星标记分析

利用233个微卫星标记检测镜鲤（Cyprinus carpio L.）一个家系的107尾个体的基因型,采用GLM方法对肌肉脂肪含量和蛋白质含量4种经济性状进行单标记回归分析。 Permutation检验结果显示：有17个标记分别与肌肉脂肪和蛋白质含量具有显著相关性（P〈0.05）,其中,有4个标记（HLJ030、HLJ2560、HLJ3633,和HLJ3554）与肌肉蛋白质含量呈极显著相关（P〈0.01）,表明这些标记与性状间可能存在连锁关系。对同一标记不同基因型之间进行了多重比较,找到了与这两种性状相关的优势基因型,为鲤的肌肉品质性状选育提供了有效的依据。     

肌间刺缺失突变对斑马鱼胚胎发育过程中肌肉发育的影响

为阐明肌间刺缺失对斑马鱼(Danio rerio)胚胎发育时期肌肉发育的影响,采用qRT-PCR的方法,检测分析了斑马鱼不同肌间刺表型间5个肌肉特异性基因(mef2、myf5、myod、myog和sox6)在囊胚期(3hpf,hourspost fertilization)、原肠胚期(6 hpf)、体节期(12 hpf)、咽囊期(24 hpf)和孵化期(72 hpf)5个发育时期的表达情况,对比分析了肌间刺缺失对斑马鱼胚胎发育过程中肌肉发育特异性基因的时序表达差异和肌肉发育的影响,以及对受精率、孵化率和畸形率的影响。结果显示, 5个特异性基因在肌间刺缺失突变型与野生型斑马鱼各发育时期的表达量无显著性差异(P0.05)。其中,myf5、myod基因在原肠胚期表达量升高,在体节期和咽囊期开始逐步下降;mef2、myog和sox6基因在囊胚期和原肠胚期表达量很低,在体节期和咽囊期表达量迅速升高,并在孵化期开始下降。此外,受精率、孵化率和畸形率的统计结果显示,肌间刺突变型与野生型间亦无显著性差异(P0.05)。综上,推测肌间刺的缺失对斑马鱼胚胎发育及胚胎发育过程中肌肉的发育没有影响。     

一种杂交鲤四种经济性状的QTL定位分析

以柏氏鲤和荷包红鲤抗寒品系杂交F21个家系的92尾个体为材料,用300个微卫星(SSR)标记构建了遗传连锁图谱,其长度为2 471.7 cM,标记间平均间隔为10.75 cM,在此基础上对体长(SL)、体厚(BT)、体高(H)和体质量(W)进行QTL定位分析.共检测到17个QTL区间分布于6个连锁群.4个体长的QTL中,位于LG5、LG7和LG19的QTL为显著水平(P＜0.05),位于LG32的QTL为极显著水平(P＜0.01),可解释表型变异率为5.14％～10.2％;4个体厚的QTL中,位于LG11(两个QTL)和LG32上的QTL为显著水平(P＜0.05),位于LG5的QTL达极显著水平(P＜0.01),可解释表型变异率为6.42％～ 8.43％;6个体高的QTL中,LG5,LG10,LG11,LG19,LG32上的QTL为显著水平(P＜0.05),LG7上达极显著水平(P＜0.01),可解释表型变异率为5.92％ ～ 8.95％;3个体质量的QTL中,位于LG5和LG7上的为显著水平(P＜0.05),可解释表型变异率为5.55％和8.36％,LG32上达极显著水平(P＜0.01),可解释表型变异率为6.44％.本研究采用了两个不同品系的杂交子代为作图群体,丰富了QTL研究群体的多样化,为今后不同鲤品系或品种间的QTL在全基因组水平上的比较和共性QTL的发掘等奠定基础,进而指导鲤分子育种.     

梭鲈GH基因序列特征及其在生长差异个体间的表达分析

本研究旨在克隆梭鲈(Sander lucioperca)生长激素(growth hormone, GH)基因, 探究其序列特征及其表达量与梭鲈生长的相关性, 以期为梭鲈生长的分子机理研究鉴定基础。研究采用 RACE 技术从梭鲈垂体中克隆了 GH 基因, 其 cDNA 全长为 926 bp, 包含 74 bp 的 5′非翻译区、237 bp 的 3′非翻译区和编码 204 个氨基酸的开放阅读框。 氨基酸多重比对发现, 梭鲈 GH 与黄金鲈(Perca flavescens)、河鲈(Perca fluviatilis)的氨基酸序列相似性分别为 97.04%和 94.05%, GH 基因在鱼类和哺乳动物中都存在四个保守的半胱氨酸残基位点。应用实时荧光定量 PCR 技术分析了 GH 基因在梭鲈各组织和体重极端差异个体间的表达特征, 结果显示, GH 基因在梭鲈各组织中均有表达, 垂体中相对表达量最高, 脑次之, 与其他组织相比差异极显著(P＜0.01)。GH 基因表达量与梭鲈体重呈正相关, 4 个组织中 GH 基因表达量均为体重极大组高于极小组, 其中垂体和脑中差异极显著(P＜0.01), 肌肉中差异显著 (P＜0.05)。因此, GH 基因可以作为梭鲈生长候选基因用于分子选择。本研究结果可为进一步解析 GH 基因调控梭鲈生长发育的分子机制研究提供参考。