农杆菌介导的花生Δ12脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2 RNAi抑制表达遗传转化研究

以成熟花生种子萌动4d的上胚轴为受体材料,采用农杆菌介导的转化方法,将倒位重复Δ12脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2片段分别与CaMV35S启动子和种子特异性表达的大豆凝集素启动子相连导入花生.经PCR检测证实含有AhFAD2倒位重复基因片段的RNAi抑制表达框架已成功转入花生.     

AhFAD2 RNAi抑制表达遗传转化研究**

以成熟花生种子的萌动4d的上胚轴为受体材料，采用农杆菌介导的转化方法，将倒位重复Δ12脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2片段分别与CaMV35S启动子和种子特异性表达的大豆凝集素启动子相连导入花生。经PCR检测证实含有AhFAD2倒位重复基因片段的RNAi抑制表达框架已成功转入花生。     

花生高效离体再生体系的建立

建立了以花生胚轴为外植体,通过器官发生途径高效率诱导丛生芽发生的技术体系。该体系芽分化诱导率高达83%,外植体平均出芽数为6.8个,重复性好。同时建立了花生幼胚离体培养再生体系,通过胚状体发生途径获得理想的体胚,并再生出正常的植株。     

花生AhFAD2A基因启动子的克隆与序列分析

利用染色体步移技术,从花生品种鲁花14中克隆到716 bp的AhFAD2A基因启动子片段。序列分析表明,该启动子中含有多种种子特异性表达的元件,如GCN4基序、AGCCCA序列元件、Skn-1基序等,可能与AhFAD2A基因在种子中有较高的表达水平有关。启动子中预测的调控元件的功能还需进一步实验验证。     

高通量检测花生油酸含量相关基因AhFAD2等位变异的方法

花生(Arachis hypogaea)△12脂肪酸去饱和酶基因(△12 fatty acid desaturase,AhFAD2A和AhFAD2B)是决定花生籽粒油酸含量和高油酸亚油酸比值(oleic acid/linoleic acid,O/L)的关键基因,高油酸花生品种中这2个基因均发生突变.针对普通油酸花生和高油酸花生AhFAD2A 448位G/A差异和AhFAD2B 442位A碱基的插入/缺失(insertion-deletion,InDels)等位差异,已开发了包括酶切扩增多态性序列法(cleaved amplified polymorphic sequence,CAPS)和等位基因特异PCR(allele-specific PCR,AS-PCR)等多种检测的标记和检测方法.本研究针对上述2个SNP位点,开发了可进行高通量检测的实时定量PCR引物、TaqMan 探针和检测技术,该方法检测效率和准确率均很高.本研究还开发了更为经济和高效的竞争性等位基因特异性PCR(kompetitive allele specific PCR,KASP)引物和检测方法.利用开发的TaqMan探针检测方法和KASP方法检测了14个花生品种和高油酸选育回交组合BC2F1和BC1F2群体部分种子的基因型,并比较了两种方法检测结果的一致率,发现这两种方法检测AhFAD2B 442 nt A/-InDel差异结果的一致率高达96.7％;而针对AhFAD2A 448位G/A差异位点检测一致率仅为71.7％.本研究还比较了目前常用的CAPS、AS-PCR、测序法、TaqMan探针法及KASP方法的优缺点,对相关方法的应用前景进行了讨论.本研究涉及的高通量检测方法可有效地辅助高油酸品种的选育,极大地提高了目标性状选择的准确性和效率.     

花生AhDGAT2a基因启动子的克隆和功能验证

二酰甘油酰基转移酶(DGAT)是三酰甘油(TAG)合成途径的限速酶,对脂肪酸合成的调节具有关键作用。为了研究AhDGAT2a的表达调控,利用GenomeWalking方法从鲁花14基因组中克隆了AhDGAT2a上游5¢侧翼调控区1200 bp序列,即AhDGAT2a启动子(pAhDGAT2a)序列,并利用生物信息学软件分析其包含的调控元件,发现其含有多个TATA-box和CAAT-box、光调控元件、胁迫防御相关元件和激素响应元件。用pAhDGAT2a构建pAhDGAT2a:GUS植物表达载体并转化烟草品种SR1。利用组织染色法鉴定转基因烟草的GUS表达模式,发现在转基因烟草的各个器官均有GUS酶活,而在柱头、花药和幼嫩种子中表达量较高,说明pAhDGAT2a具有一定的组成型启动子活性。     

双抗TMV CMV辣椒转基因工程植株的再生及抗病毒鉴定

本研究在已构建ＴＭＶｃｐ和ＣＭＶｃｐ双价植物表达载体,建立辣椒高效遗传转化体系 的基础上,以农杆菌介导的转化法转化辣椒栽培品种：农大４０及湘研一号,对获得的５２株抗卡 那霉素再生植株进行点杂交鉴定及ＰＣＲ检测,点杂交获得１６株ＴＭＶ和ＣＭＶｃｐ基因同时表 现阳性的植株,ＰＣＲ检测发现有２株为假阳性。进一步温室攻毒试验表明,有７株转基因辣椒植 株对ＴＭＶ和ＣＭＶ同时表现免疫。     

拟南芥LRR-Extensin蛋白家族的研究

LRR-Extensin(LRX)是一种定位于植物细胞壁中的蛋白,其结构中含有富含亮氨酸的重复序列和伸展蛋白结构域。LRX蛋白的功能众多,除了促进细胞生长外,还影响营养生长、形态发生、授粉受精等,随细胞基质不同具有不同的功能,并表现出高度的组织、器官和细胞特异性。介绍了拟南芥中LRX的分类、结构特征、表达形式及其在根毛和花粉发育中的作用。     

花生株型与高产

花生(Arachis hypogaea L.)是我国重要的油料作物,在我国食用油供给中具有重要作用,因此提高花生产量对于推动我国花生产业发展至关重要。自上世纪六十年代以来,我国花生主推品种以直立型为主,该株型结果集中,可以密植,能够满足当时小农经济手工劳作的需求。但是相比于蔓生型和半蔓生型花生来说,直立型花生用种量大、投入高、产量偏低,已经越来越不能满足现代化生产的要求。美国花生品种以蔓生型为主,花生单产高于我国,但是在我国发展蔓生型花生不切合我国耕地紧缺的实际情况,因此培育半蔓生型高产花生新品种是当务之急。本文分析了直立型花生对产量的限制性,论证了半蔓生型高产花生的优势,以期为我国花生高产育种提供一定的理论支持。     

一种从花生种子中提取RNA的改进方法

花生种子中富含蛋白质、多糖和酚类化合物,从而增加了从中提取RNA的难度。作者通过实验对几种方法做了比较,并对其中的异硫氰酸胍方法稍做改变,结果得到的RNA产率较高,质量好,符合分子生物学实验要求。