水产动物分子标记辅助育种研究进展

本文介绍了水产动物分子标记辅助育种技术的发展。获得与经济性状连锁的标记是开展分子标记辅助育种的基础,因此,本文重点介绍了获得基因/标记技术的进步,探讨了基因/标记与性状间相互关系的复杂性,论述了准确鉴定性状紧密连锁的基因/标记的难度,指出难点主要源于基因组对性状的形成具有非常复杂的影响。近十年来,已有多个利用分子标记辅助育种技术培育的品种在产业上应用,表明这项新技术具有推动产业技术进步的作用;同时指出了分子标记辅助育种包括全基因组选择育种的不足之处,其根本原因在于鱼类性状的形成机制极其复杂、多变,从而决定了分子标记辅助育种技术具有发展阶段论的特征。     

东北鳈繁殖力的研究

2018年6—7月,在乌苏里江抚远江段采集了284尾东北鳈Sarcocheilichthys lacustris,研究其生物学体征、种群年龄组成及繁殖力。结果表明:284尾东北鳈中有雌鱼226尾、雄鱼58尾,雌雄比例为3.9∶1;年龄范围1~5龄,3~4龄年龄组个体为优势年龄组,占总样本量的68%;性腺成熟系数(GSI)为(11.27±5.62)%,绝对繁殖力(F)为(5924.69±2177.01)粒,相对繁殖力(F1)为(60.81±15.25)粒/g,体长相对繁殖力(FL)为(33.02±10.66)粒/mm,体质量相对繁殖力(FW)为(49.41±11.61)粒/g;个体绝对繁殖力与体长(L)、体质量(W)及GSI的关系分别为:F=1170.8L-2.6L2-119577,F=320.65W-0.9W2-18919,F=143.89GSI1.452。     

鲤lipea基因表达的时空特征及与脂肪沉积相关性分析

本文旨在克隆鲤(Cyprinus carpio)激素敏感性脂肪酶a (hormone-sensitive lipase a, lipea)基因,探究其时空表达特征及其与脂肪沉积的关系,以期为鲤脂肪沉积分子调控机制研究奠定理论基础。本实验采用RACE技术克隆获得鲤lipea基因,其cDNA全长为3379 bp,包括230 bp的5′非翻译区(5′-UTR)、1067 bp的3′非翻译区(3′-UTR)和编码693个氨基酸的开放阅读框。多序列比对显示,鲤lipea与斑马鱼(Danio rerio)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)和虹鳟(Oncorhynchusmykiss)的氨基酸序列相似性分别为88.17%、64.94%和63.35%,不同物种间序列差异主要集中在C-端的多肽序列上。蛋白质结构分析显示该蛋白含有3个功能域分别具有脂肪酶活性、乙酰基水解酶活性和水解酶活性。应用实时荧光定量PCR技术分析了lipea基因在鲤各组织、不同发育时期以及脂肪含量极端差异个体的肌肉和脂肪组织中mRNA表达量的变化。结果显示, lipea在各组织中均有表达,腹腔脂肪中相对表达量最高,其次是腹部肌肉,血液中最少。随着胚胎的发育, lipea的表达水平呈现下降趋势, 8细胞期表达量最高,其次是囊胚晚期,开口期最少。lipea表达量与背部肌肉脂肪含量呈正相关,但差异不显著(P0.05),与腹腔脂肪量呈负相关,且差异极显著性(P0.01),推测lipea基因对鲤腹腔脂肪沉积可能具有抑制作用。本实验结果可为进一步解析鲤lipea基因的功能和基因调控脂肪沉积分子机制研究提供参考。     

利用GoldenGate分析的高通量SNP芯片对鲤基因进行分型

单核苷酸多态性(SNPs)标记在大多数物种基因组中数量巨大且分布均匀,是许多水产物种遗传研究的理想标记,因此快速发展了几种高通量、快速的SNP标记分型平台。本研究利用Golden Gate分析技术对鲤Cyprinus carpio转录组测序的1 536个SNP标记合成了一张中等密度SNP芯片,对5个鲤群体的480份样本进行基因分型。结果表明:1 235个SNP标记成功分型,约占80%;915个标记至少在一个家系中呈现多态性,占74.1%;标记最小等位基因频率(MAF)介于0.05~0.5之间,平均为0.334,其中48.9%的标记最小等位基因频率(MAF)大于平均值;5个群体中SNP标记平均多态性信息含量(PIC)在0.3左右,为中度多态,杂合度为0.010~0.990,平均为0.5左右,暗示群体具有丰富的遗传多态性,育种价值及性状改良潜力很大。本研究分型的多态性SNP标记可广泛应用于遗传多样性研究、标记-性状关联分析以及分子标记辅助育种。     

哲罗鱼AFLP技术体系建立的研究

以哲罗鱼为材料提取DNA,采用两组限制性内切酶组合酶切基因组,并对酶量、酶切时间、扩增时稀释倍数及镁离子的浓度进行优化,结果表明200 ngDNA用4 U的EcoRI和PstI在37℃酶切4 h后,再分别用4 U的Tru9I和TaqI在65℃酶切4 h后用3 U的T4连接酶连接3 h,进行预扩增,预扩增产物稀释100倍后选择扩增效果最佳,得到了清晰稳定的扩增图谱;并对两组酶切组合的扩增结果进行了比较,结果显示EcoRI、Tru9I酶切组合扩增的条带数要多于PstI、TaqI酶切组合扩增的条带数,但后者的多态性要高于前者。本研究为采用该技术对哲罗鱼基因组的研究提供了参考。     

镜鲤△6脂肪酸脱氢酶CDNA的克隆与表达

利用RT-PCR和RACE方法克隆得到镜鲤Cyprinus carpio肝脏中高不饱和脂肪酸(HUFA)合成代谢的脂肪酸去饱和酶(△6FAD)基因c DNA全序列。结果表明:镜鲤△6FAD基因c DNA全长为1 446bp,开放阅读框(ORF)为1 332bp,编码444个氨基酸。编码的蛋白序列包含FAD全部特征结构区,包括1个细胞色素b5结构域、2个跨膜区和3个组氨酸簇,与其他鱼类的Δ6FAD氨基酸序列具有69.0%~92.0%的同源性。系统树分析显示:与斑马鱼Danio rerio的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测发现:脂肪酸延长酶基因在镜鲤肝脏中表达量最高,背部肌次之,在血液中表达最低。本研究结果为进一步研究镜鲤HUFA的合成途径及调控机理提供了基础资料。     

北极茴鱼形态性状对体重影响效果分析

为探明北极茴鱼(Thymallus arcticus)形态性状与体重的关系, 以 1⁺ ~3⁺ 龄北极茴鱼为研究对象, 测定了体重(Y) 和体厚(X₁)、眼间距(X₂)、体长(X₃)、体高(X₄)、头长(X₅)、眼径(X₆)、吻长(X₇)、尾柄长(X₈)、尾柄高(X₉)等 9 个形态性状, 利用相关分析、通径分析和多元回归分析等方法, 筛选出影响北极茴鱼体重的主要形态性状, 并建立回归方程。结果显示: (1) 不同年龄阶段, 与北极茴鱼体重显著相关(P＜0.05)的形态性状种类不同, 且数量也随着年龄的增加而降低。(2) 通径分析在 1⁺ ~3⁺ 龄北极茴鱼中分别保留了 4、4 和 2 个形态性状, 1⁺ 龄北极茴鱼中体长(X3)的直接作用最大(0.345), 尾柄高(X9)的间接作用最大(0.745); 2⁺ 龄北极茴鱼中体高(X4)的直接作用最大(0.473), 体厚(X1)的间接作用最大(0.378); 3⁺ 龄北极茴鱼中体厚(X₁)的直接作用最大(0.635), 尾柄高(X₉)的间接作用最大(0.344)。(3) 通径分析保留的形态性状对 1⁺ ~3⁺ 龄北极茴鱼体重的总决定系数较高, 分别为 0.943、0.778 和 0.997。(4) 多元回归分析拟合出 1+ 龄北极茴鱼形态性状(Xi)与体重(Y)回归方程为 Y=?90.510+15.345X₁+3.638X₃+10.473X₄+16.884X₉, 2+ 龄北极茴鱼形态性状(Xi)与体重(Y)回归方程为 Y=?142.449+29.023X₁+81.082X₂+27.126X₄?47.376X₇, 3⁺ 龄北极茴鱼形态性状(Xi)与体重(Y)回归方程为 Y=?228.922+75.063X₁+107.864X₉。本研究丰富了北极茴鱼基础生物学数据, 同时为将来人工养殖利用过程中北极茴鱼的选择育种提供待选形态性状。     

镜鲤碱性磷酸酶和酸性磷酸酶QTL 定位分析

磷酸酶普遍存在于动物的各组织中,对磷酸单酯键具有水解活性,是机体生长代谢、保持内环境稳定和维持机体健康所必需的酶。以镜鲤(Cyprinus carpio L.)全同胞家系190个个体为材料,用992对微卫星(SSR)标记进行基因组扫描,采用区间作图法,对肠组织的碱性磷酸酶和酸性磷酸酶进行了QTL定位分析。QTL检测显示:5个QTL区间与酸性磷酸酶活性相关,其中3个QTL为99%染色体水平显著性,分别位于LG2(CA2049-CA2371)、LG25(HLJ2941-HLJ3946)和LG28(CA2263-HLJ2873),另外两个QTL区间为95%染色体水平显著性,位于LG14(HLJ3275-CA174)和LG14(CA1276-CA2208),解释表形变异率范围为8.1%～38.9%;2个与碱性磷酸酶相关的QTL区间均为95%染色体水平显著性,分别位于LG8和LG13,可解释变异率分别为7.3%和7.0%。     

高温胁迫对哲罗鱼血液指标和热休克蛋白基因的影响

为探讨高温对哲罗鱼(Hucho taimen)血液指标和热应激蛋白基因表达的影响,本研究选取50尾2龄哲罗鱼进行高温胁迫试验.结果显示:高温时哲罗鱼体内供氧相关的红细胞和血红蛋白增加;淋巴细胞上升,但非特异免疫的中性粒细胞和单核细胞功能受到抑制;肝功能指标显示ALP增高;肾功能指标CREA-S含量表现先下降后上升的趋势...     

三种CRISPR/Cas9基因敲除变异检测方法的比较分析

比较三种常用的CRISPR/Cas9基因敲除检测变异方法,从准确性、耗时、成本和应用限制等方面进行评估。采用T7核酸内切酶I、限制性内切酶和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法分别对利用CRISPR/Cas9方法敲除的fibinb和ngs基因的50尾斑马鱼(Danio rerio)突变纯合个体和突变杂合个体进行检测,用野生型个体作对照;同时用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对CRISPR/Cas9方法敲除的ogn和ddb1基因的突变杂合个体进行了检测。结果表明:三种方法均能够区分突变杂合个体,其中T7核酸内切酶I检测法耗时最短,但该方法不能用于鉴定突变纯合个体;限制性内切酶检测法能够用于鉴定纯合个体,但需要有特异性的识别位点;非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法能够区分纯合和杂合个体,对序列无依赖性,能够检测出序列中存在的所有变异。成本上,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法最经济;限制性内切酶的价格存在较大的差异,因此检测成本依赖于酶的价格。三种检测方法各有优缺点,在应用实践中可根据试验需要选择合适的方法。