镜鲤△6脂肪酸脱氢酶CDNA的克隆与表达

利用RT-PCR和RACE方法克隆得到镜鲤Cyprinus carpio肝脏中高不饱和脂肪酸(HUFA)合成代谢的脂肪酸去饱和酶(△6FAD)基因c DNA全序列。结果表明:镜鲤△6FAD基因c DNA全长为1 446bp,开放阅读框(ORF)为1 332bp,编码444个氨基酸。编码的蛋白序列包含FAD全部特征结构区,包括1个细胞色素b5结构域、2个跨膜区和3个组氨酸簇,与其他鱼类的Δ6FAD氨基酸序列具有69.0%~92.0%的同源性。系统树分析显示:与斑马鱼Danio rerio的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测发现:脂肪酸延长酶基因在镜鲤肝脏中表达量最高,背部肌次之,在血液中表达最低。本研究结果为进一步研究镜鲤HUFA的合成途径及调控机理提供了基础资料。     

用磁珠富集法制备史氏鲟的微卫星分子标记

采用生物素-磁珠富集法与放射性同位素杂交法相结合的方式,研究了史氏鲟Acipenser schrencki基因组的微卫星资源。结果表明:在得到的1 400多个细菌中,有300多个阳性克隆,将其中96个进行测序,在这些序列中共有115个微卫星核心序列,含99个重复次数大于10次的微卫星核心序列。其中完美型标记40个,占40.4%;非完美型标记52个,占52.5%;混合型标记共7个,占7.1%。随机选取侧翼序列较长的50个序列,依据引物设计原理设计引物50对,经3次PCR筛选,有28对引物可得到稳定的特异性扩增;同时利用史氏鲟的6个个体检验了这些位点的多态性,并统计了等位基因数,发现有22对等位基因具有良好的多态性。     

哲罗鱼耗氧量与体重、水温的关系

通过对 2 2 5g、 2 2 7 5g、 2 60g 3组体重范围 ,在 8℃、 1 2℃、 1 6℃、 2 0℃ 4个水温范围下的哲罗鱼耗氧量的测定 ,研究了哲罗鱼耗氧量与体重、水温的关系。结果表明 :耗氧量随着体重和水温的增加而增加 ,在 1 2℃～ 1 6℃水温范围 ,温度增加 ,但耗氧率增加不显著 ,认为此水温为哲罗鱼生长的适宜水温。水温在 1 6℃时 ,耗氧量与体重的关系为 :R =0 2 962W0 90 82 (R :耗氧量 ,mg/h·尾 ,W :体重 ,g) ;在体重 2 60g时 ,耗氧量与水温的关系为 :R =1 5 496 +1 8776T (R :耗氧量 ,mg/h·尾 ,T :水温 ,℃ )。     

根据mtDNA控制区序列分析野生唇 的种群遗传结构

为了掌握不同地理种群唇(鱼骨)(Hemibarbu labeo)的遗传多样性和遗传结构,探讨其亲缘地理演化过程,研究分析了乌苏里江、长江、黑龙江、鸭绿江和牡丹江5大水系,8个地理群体(n=42)的mtDNA控制区404 bp片段的变异,该片段共有26个变异位点,变异率为6.43%,平均核苷酸多样性为0.011 5.42尾样本共检测到18个单倍型,这8个地理群体是以HT1和HT2单倍型为中心向外辐射演化的.AMOVA分析结果表明,群体内变异为59.29%,同一水系群体间变异为23.50%,不同水系群体间变异为17.20%,以上变异均达到显著水平(P＜0.05),群体间配对FST分析结果表明,同一水系内有些群体间差异也达到了显著水平.聚类分析发现,最大简约法(MP)和最大似然率法(ML)结果基本一致,嘉荫群体(HRJY)和四川群体(YRSC)绝大部分个体被聚在一支,鸭绿江群体(YRLJ)聚在一支,这与单倍型网络的分析结果一致,以上结果表明唇(鱼骨)的遗传多样较为丰富,黑龙江流域的唇(鱼骨)保持了祖先单倍型,其他地理群体为黑龙江流域内群体向不同方向演化的结果,并且部分地理群体已经形成了特有的单倍型.     

镜鲤两个繁殖群体的遗传结构和几种性状的基因型分析

利用扩增效果好、在群体中具有多态性的28个微卫星标记,检测国家换新良种场的镜鲤繁殖群体和黑龙江水产研究所松浦实验场的镜鲤繁殖群体的遗传组成,计算了两个群体的有效等位基因数,期望杂合度和多态信息含量等遗传参数,换新与松浦两个群体的有效等位基因数分别为2.874和3.102, 期望杂合度分别是0.565和0.603,多态信息含量分别是0.534和0.568;遗传结构分析研究结果表明这两个群体的多样性较高,信息含量丰富,具有进一步筛选出优良品种的遗传基础。但连锁不平衡分析表明这两个群体在较大的选择压力下,已严重偏离Hardy-Weniberg平衡,要保持群体的优良性状相关的遗传基础,应该在进一步的选种中注意增加群体的遗传多样性。也用28个基因座的不同基因型与换新208个亲本的体重值进行了连锁分析,得到12个与镜鲤体重相关的基因型,其中紧密相关的基因型3个;分析了一些严重偏离平衡的基因型,并分析了出现这种现象的可能原因,同时探讨了一些基因型与胚胎期致死或易感病基因连锁的可能性。为描述基因型偏离程度,创造了基因型偏离指数,并用其对群体中一些基因型出现的偏离现象进行了探讨。图1表2参19     

哲罗鱼AFLP技术体系建立的研究

以哲罗鱼为材料提取DNA,采用两组限制性内切酶组合酶切基因组,并对酶量、酶切时间、扩增时稀释倍数及镁离子的浓度进行优化,结果表明200 ngDNA用4 U的EcoRI和PstI在37℃酶切4 h后,再分别用4 U的Tru9I和TaqI在65℃酶切4 h后用3 U的T4连接酶连接3 h,进行预扩增,预扩增产物稀释100倍后选择扩增效果最佳,得到了清晰稳定的扩增图谱;并对两组酶切组合的扩增结果进行了比较,结果显示EcoRI、Tru9I酶切组合扩增的条带数要多于PstI、TaqI酶切组合扩增的条带数,但后者的多态性要高于前者。本研究为采用该技术对哲罗鱼基因组的研究提供了参考。     

利用OneMap软件构建鲤遗传连锁图谱

首次使用R环境中的OneMap软件包,以荷包红鲤抗寒品系(♂)和云南大头鲤(♀)为祖父母本所培育的110个F2个体为作图群体,以荧光扩增片段长度多态性(fluorescent amplification fragment length polymorphism,fAFLP)为主要分子标记,采用远交全同胞家系模型构建鲤的遗传连锁图谱。结果显示,110个F2个体中共产生1513个清晰的fAFLP标记,其中多态性标记911个;另开发多态性的EST标记12个,最后总计923个标记用于构建遗传连锁图谱;采用OneMap软件包构建的遗传图谱含有238个fAFLP标记和8个EST标记分布在50个连锁群上,总图距为2876.64cM,标记间平均间距为14.68cM,图谱覆盖率为66.56%。     

不同温度下哲罗鲑幼鱼生长性状的遗传参数估计

采用每4个雄性亲本与1个雌性亲本交配的巢式设计方法,建立哲罗鲑(Hucho taimen)9组母系半同胞、34个父系全同胞家系.19个家系置于(13±1.5)℃(高温),15个家系置于(9±1.5)℃(低温)条件下饲养,计算幼鱼各月龄的体质量和体长性状的遗传力和遗传相关.结果表明,哲罗鲑幼鱼在低温条件下体质量遗传力为0.413～0.675,体长遗传力为0.297～0.777;高温条件下体质量遗传力为0.396～0.558,体长遗传力为0.194～0.624,均属于中高遗传力.在2个温度条件下母本间遗传方差组分均大于父本间遗传方差组分,存在较大的母本效应或显性效应,而根据父本间遗传方差组分估计的遗传力较为无偏.低温条件下体长、体质量遗传力估计值高于高温条件下的估计值,表明基因和环境互作效应较为明显,在低温条件下对体长和体质量进行选择能达到更好的效果.体长和体质量在不同生长时期、不同温度条件下都具有显著的遗传正相关和表型正相关(P＜0.05),表型相关系数为0.815～0.939,遗传相关系数为0.794～0.939,表明通过体质量或体长进行选育均能达到改良生长性状的目的.     

哲罗鱼人工育苗技术研究

采捕野生乌苏里江哲罗鱼(Hucho taimen Pallas)幼鱼,在流水池塘中培育至性腺成熟,进行人工繁殖和育苗技术的研究.结果表明:注射催产激素HCG、S-GnRH-A和DOM的混合制剂可促使成熟的亲鱼排卵,(9±2) ℃水温药物的效应时间在8～11 d.哲罗鱼的受精卵,为圆形、淡黄色,卵膜较软,无粘性.7 ～9 龄鱼的卵径为4.20～5.56 mm[平均(4.98±0.33) mm];吸水膨胀后的卵径为4.32～5.76 mm[平均(5.20±0.38) mm],增大约0.2 mm.6～12 kg的雌性亲鱼绝对产卵量为4 500～14 000粒/尾,相对产卵量1 000～1 200 ind/kg.哲罗鱼人工繁育的催产率、发眼率和仔鱼上浮率平均为87.5%、83.5%和86.4%.从卵受精到破膜需28～31 d[平均(29.3±1.3) d],完全出苗需38～41 d[平均(38.5±1.0) d],仔鱼上浮需56～58 d[平均(57.1±0.9) d].鱼苗驯化依次投喂水蚤→水蚤、水丝蚓→水丝蚓→水丝蚓、软颗粒饲料→软颗粒饲料→软颗粒饲料、硬颗粒饲料→硬颗粒饲料,可从动物性饵料转化为人工配合颗粒饲料喂养.人工养殖条件下,仔鱼体长与日龄的回归方程为L=1.9623e0.0219t,(R2=0.9507,n=30),稚鱼体长与日龄的回归方程为L=2.6877e0.0119t,(R2=0.9943,n=30),1龄鱼的平均体长为(16.2±0.93) cm,体重为(28.45±2.98) g.     

eomesa功能缺失对斑马鱼雌鱼生殖的影响

eomesa基因是T-box基因家族重要的转录因子,eomesa突变导致雌性斑马鱼(Danio rerio)生殖障碍,但其机制未知.本研究利用CRISPR/Cas9 技术构建了eomesa纯合突变系(eomesa-/-),对其进行了繁殖能力分析、卵巢组织学观察及采用qRT-PCR分析了6 个性腺发育相关基因在突变体 12 hpf(hours post fertilization)胚胎和 45 dpf(days post fertilization)、60 dpf、90 dpf 3 个胚后发育阶段中的表达水平变化,以期探讨eomesa影响雌性斑马鱼生殖障碍的机制.研究结果表明,eomesa-/-斑马鱼存在背鳍和臀鳍缺失的表型,雄鱼比例显著增加,可自然繁殖,而雌鱼不能自然排卵,但可通过人工按压腹部排出卵子并以人工授精方式获得正常发育的子代;eomesa-/-斑马鱼卵巢和输卵管形态正常,但卵母细胞发育滞后,胚胎发育观察发现突变体原肠胚外包延迟,且胚胎畸形率显著增加.qRT-PCR结果显示,原始生殖细胞标志基因dnd1 和nanos3 在胚胎发育体节期(12 hpf)突变体中的表达量显著低于野生型的表达量;dnd1、vasa和nanos3 在45 dpf时突变体卵巢组织中的表达量显著高于野生型的表达量;在90 dpf时突变体卵巢组织中cyp17a1 和amh基因的表达量显著低于野生型的表达量;而dmrt1 基因在突变体中的表达量极显著高于野生型的表达量.推测eomesa基因敲除干扰了生殖细胞的发育和分化,以及排卵机制,并影响了cyp17a1 和dmrt1 的表达,致使雌雄分化异常.