虹彩病毒蛙病毒属病毒实时荧光PCR检测方法的建立

在GenBank 中搜寻虹彩病毒蛙病毒属主衣壳蛋白(MCP)基因序列并进行多重比较后,利用其中的保守序列,设计引物和Taqman探针,建立了虹彩病毒蛙病毒属实时荧光PCR检测方法.对荧光PCR反应条件进行优化,评估该检测方法的特异性、稳定性和重复性,利用10倍系列稀释法检验其灵敏度并与常规PCR做了比较.结果显示,该方法对虹彩病毒蛙病毒属成员(新加坡石斑鱼虹彩病毒除外)的检测有高度的特异性,与淋巴囊肿病毒、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒、真鲷虹彩病毒、锦鲤疱疹病毒等其他水生动物病毒之间均无交叉反应,有良好的特异性,检测总DNA灵敏度为4.5×10-3pg/μL,比传统PCR的敏感度高出100倍,可对低病毒含量的样品进行准确检测.制作的标准曲线有极好的线性关系,且线性范围宽,相关系数为0.998 4.组内和组间重复试验的Ct值标准偏差分别为1.2%和1.6%,有良好的重复性.与常规的PCR相比较,该方法具有快速、特异、敏感、可定量、可同时检测大量样品等优点,可用于出入境检疫和动物防疫监督部门对虹彩病毒蛙病毒属的疫情监测.     

鲤科疱疹病毒2型 Taqman实时荧光PCR方法的建立

本研究针对鲤科疱疹病毒2型（CyHV-2）的主要衣壳蛋白基因,设计了特异性引物和Taqman探针,建立了实时荧光PCR方法。其检测下限为83拷贝,标准曲线R2＞0.998,且经比对,灵敏度与现行方法相当。选取了健康异育银鲫、金鱼、鲤鱼以及常见4种水生DNA病毒以及7种水生环境细菌进行特异性实验,结果均无交叉反应。重复性实验显示,2份独立的15次重复结果变异系数均小于2%,说明本方法重复性好。本方法能作为目前CyHV-2疫病检测方法的有效补充,对该病的防控具有重要的意义。     

免疫胶体金技术及其在水生动物疫病诊断上的应用

免疫胶体金技术在检测生物病原方面的作用已受到众多研究者的重视,利用免疫胶体金技术进行水生动物疫病检疫的方法也越来越成熟.本文从胶体金技术的基本原理、制备方法、标记技术和实际应用等几个方面对胶体金技术作较系统的介绍,并分析了免疫胶体金技术在水生动物疫病诊断上的应用前景.     

世界动物卫生组织One Health总体框架及最新关注方向

近年来,人兽共患病在全球越来越多的地方影响人类和动物的健康。在此背景下,由联合国粮食及农业组织(FAO)、世界卫生组织(WHO)和世界动物卫生组织(WOAH)三方国际组织提出了“One Health”的概念。2021年底,FAO、WOAH、WHO和联合国环境规划署(UNEP)共同成立了One Health高级别委员会(One Health High Level Expert Panel, OHHLEP),并将“One Health”重新定义。论文就“One Health”的概念、提出的背景、重要发展进程、总体框架和协调机制以及未来应用展望进行了全面的介绍和阐述,为我国进一步深入了解“One Health”理念,实践并更好地应用“One Health”方法,从而解决我国人兽共患病、抗生素耐药等对人类、动物和环境危害严重的问题提供思路和参考。     

鱼类神经坏死病病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及其特性

鱼类病毒性神经坏死病毒能引起多种海水鱼类中枢神经组织病变,给各国海水养殖业造成了巨大的损失。本研究利用RT-PCR技术获得病毒性神经坏死病毒0603株的衣壳蛋白基因,将其插入到杆状病毒Bac-To-Bac表达系统的pFastBacⅠ质粒中,构建了pFastBac-cp质粒。转化DH10Bac大肠杆菌后获得重组穿梭载体Bacmid-cp,脂质体介导将其转染Sf9细胞产生有感染性的重组杆状病毒AcNPV-cp。利用AcNPV-cp感染Sf9细胞后,SDS-PAGE分析可见大小约为37kD的特异性蛋白带, Western-blotting分析发现,其可以与病毒性神经坏死病毒阳性血清反应出现特异性的杂交带,试验结果表明AcNPV-cp在Sf9细胞中成功地表达了病毒性神经坏死病毒的衣壳蛋白,其具有良好的免疫学活性。负染电镜观察发现,CP蛋白可自行装配成病毒样颗粒,其大小形态类似于病毒性神经坏死病毒。制备超薄切片后电镜观察发现,CP蛋白自行装配成的病毒样颗粒呈晶格状排列在细胞质中。 本研究为研制有效防控鱼类病毒性神经坏死病的新型颗粒性疫苗奠定了基础。     

进口锦鲤暴发病病原的nested-PCR鉴定

为了查明锦鲤暴发性疾病的病因，将患病锦鲤的脑，肝，脾和肾等组织悬液接种到CO，CK和EPS等鱼类细胞系中培养，均未发现细胞病变，从病灶中取样进行病原菌的分离和培养，证明锦鲤有副溶血弧菌和嗜水气单胞菌的感染，制备锦鲤疱疹病毒（KHV）的2对引物KHV9/5F和KHV9/5R，KHV1和KHV2，用嵌套式聚合酶链式反应（nested-PCR)在脑和脾脏组织的抽提物中扩增出长度为412bp的特异性的DNA片段，将该片段的nested-PCR拉增产物纯化后，克隆，测序，用NCBI-Blast软件将测序结果，在Genebank中进行搜寻，比较，结果发现与注册号为AF411803的KHV基因序列的一部分片段有99%的同源性，因此初步判断这次锦鲤暴发性疾病是由KHV引起的，副溶血弧菌和嗜水气单胞菌起着继发感染的作用。     

非离子态氨及亚硝酸盐对鳜鱼苗的急性毒性试验

通过毒性试验得出：２４小时、４８小时、９６小时非离子态氨对鳜鱼苗（９－１２ｍｍ）的半致死浓度和安全浓度分别为０．９２ｍｇ／ｌ、０．４９ｍｇ／ｌ、０．３２ｍｇ／ｌ、０．０３２ｍｇ／ｌ；亚硝酸盐对鳜鱼苗（１２－１９ｍｍ）的半致死浓度及安全浓度分别为７２４．４４ｍｇ／ｌ、１９０．５５ｍｇ／ｌ、７１．６１ｍｇ／ｌ、７．１６ｍｇ／ｌ。结果表明，水体中非离子态氨对鳜鱼苗的毒性作用较明显，而鳜鱼苗对亚硝酸盐有较强的耐受力。     

斑节对虾“红体病”细菌性病原的初步研究

从患“红体病”的斑节对虾中分离到８个菌株,通过致病力试验证实其中两个菌株是引起斑节对虾“红体病”的主要病原,使对虾死亡率分别达到７０％和９０％。根据生化试验,确定这两个菌株分别是嗜水气单胞菌和副溶血弧菌。抗药性实验的结果表明,嗜水气单胞菌菌株对强力霉素较为敏感,副溶血弧菌菌株对氟哌酸、红霉素、青霉素和强力霉素较为敏感。