TaqMan实时荧光PCR快速检测斑点叉尾鮰病毒

根据GenBank登录的斑点叉尾鮰病毒株ORF8基因序列,设计引物和Taqman荧光探针,建立了用于检测斑点叉尾鮰(Ictalurus Punctatus)病毒的实时荧光定量PCR方法;对实时荧光定量PCR反应条件进行了优化,评估了该方法的特异性、灵敏度和重复性,并建立了绝对定量方法。特异性试验证实,该方法只能检测到斑点叉尾鮰病毒,与真鲷虹彩病毒、蛙虹彩病毒、锦鲤疱疹病毒、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒等多种常见的水生动物病毒没有交叉反应,具有高度的特异性。标准曲线表明,在3.3×10~3.3×107拷贝数之间有较好的线性关系(r=0.998 3),最少可检测到33个拷贝的阳性质粒,敏感度很高。同一样品于试验内及试验间的重复性试验发现,变异系数分别为0.7%和1.2%,重复性较好。该方法的检测时间从核酸抽提到出具结果仅需3h。试验结果表明,采用实时荧光PCR检测斑点叉尾鮰病毒方法具有特异性好、灵敏度高、检测耗时短的特点,并且能对病毒进行准确的定量分析,不仅适合口岸进出口检验检疫的需求,而且可以作为研究该病毒感染过程的有力工具。     

患病北极红点鲑的病原分离与鉴定

对2004年5月四川省某养殖基地养殖的北极红点鲑患病鲑进行了病理学检查和病原分离,从病灶处分离到细菌和真菌。分离到的细菌经API生化鉴定为杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(Aeromonas salmonicidasubsp.salmonicida)。用引物AP1和AP2对纯化后的细菌进行PCR扩增,结果扩增出长度为421 bp的DNA片段,对扩增片段进行克隆、测序,用NCBI-BLASTn在GenBank中搜寻相似序列,结果与杀鲑气单胞菌各株A层蛋白部分编码基因有99%以上的序列同源性。用引物EUS-F和EUS-R对分离到的真菌进行PCR扩增,结果扩增出长度为755 bp的DNA片段,对扩增片段进行克隆、测序,用NCBI-BLASTn在GenBank中搜寻相似序列,结果与水霉属各株的DNA片段(包括18S核糖体RNA基因部分序列、内转录间隔区1全序列、5.8S核糖体RNA基因全序列、内转录间隔区2全序列和28S核糖体RNA部分序列)有93%-100%的同源性;而与属于丝囊霉菌属的EUS各株相对应的DNA片段仅有60%的序列同源性。因此判定所分离的真菌为水霉。杀鲑气单胞菌是引起疖疮病和溃疡病等病的病原菌,而水霉广泛存在于水中,当鱼受伤后,水霉孢子容易从患病部位侵入鱼体,加重感染。因此判断该病主要是由杀鲑气单胞菌引起,而水霉则引起继发感染。     

真鲷虹彩病毒实时定量PCR检测方法的建立与应用

以真鲷虹彩病毒(Red-sea bream iridovirus,RSIV)主要衣壳蛋白(Major capsid protein,MCP)的基因保守片段为靶序列,利用Primer Express 3.0软件设计定量PCR引物,建立了RSIV的SYBR Green I实时定量PCR检测方法.将RSIV MCP基因连接pMD18-T载体,构建重组质粒,经过梯度稀释后作为标准品,根据标准品拷贝数(X)与Ct值的关系绘制了标准曲线,为Ct=-3.184 1gX+40.270,相关系数R2=0.996 9.熔解曲线分析表明,定量PCR产物的Tm值为82.5℃.该方法的检测限为2.20×102拷贝/反应,对流行性造血器官坏死病毒、淋巴囊肿病毒、蛙病毒3、甲鱼虹彩病毒都没有扩增反应,具有特异性.利用该方法对84批海水鱼类(石鲽、大菱鲆、鲈鱼)进行检测,其中5批鱼样品感染RSIV,并利用标准曲线对病毒含量进行了定量分析.     

牙鲆鱼淋巴囊肿病初报

牙鲆鱼（Ｐａｒａｌｉｃｈｔｈｙｓｏｌｉｖａｃｅｕｓ）淋巴囊肿病（ＬｙｍｐｈｏｃｙｓｔｉｓＤｉｓｅａｓｅ简称ＬＤ）是由虹彩病毒科（Ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ）淋巴囊肿病毒（ＬｙｍｐｈｏｃｙｓｔｉｓＶｉｒｕｓ简称ＬＣＶ）引起的一种鱼类传染病。该病毒易感鱼类广泛,对鱼类危害严重．本次发现该病在６个牙鲆鱼养殖场呈亚急性暴发。病鱼体表可见有明显的瘤样囊肿物,囊肿细胞大的达到５００μｍ。牙鲆鱼淋巴囊肿病暴发在我国为首次,疫源为外来。已建议采取综合防治措施控制疫源,防止扩散,尽快扑灭此病。     

水生动物及其养殖场的消毒

水生动物及其养殖场的消毒刘荭王侃（深圳沙头角动植物检疫局５１８０８１）国际兽疫局在１９９５年出版的《国际水生动物卫生法典（鱼类、贝类和甲壳类）》中,对鱼卵、渔场、贝类养殖场和甲壳类养殖场的消毒管理工作进行了较为详尽的阐述。我国是水产养殖和消费的大国,...     

泰国输华斑节对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒的检测与分析

为研究进口斑节对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒(Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus,IHHNV)的风险,本文采用了世界动物卫生组织(OIE)2015版手册中推荐的PCR方法,对2015年从泰国输华的329批次斑节对虾进行了IHHNV检测分析。结果发现,其阳性率高达36.8%,且主要是感染1型和2型,以及风险不明的未知型。因此,来自泰国的斑节对虾具有较高的IHHNV传入风险,应加强针对IHHNV的进口监测,减少其对我国对虾养殖的影响。     

鲤春病毒血症病毒糖蛋白基因的克隆及其在毕赤酵母中的初步表达

根据SVCV糖蛋白基因序列设计引物,在5’引物和3’引物中分别引入酶切位点。以病毒核酸为模板用RT-PCR方法扩增该段糖蛋白基因,将所得的基因片段(517和521)克隆至穿梭载体pGAPZαA/B之GAP启动子下游位点,构建含α信号肽的重组表达载体。获得的重组质粒pGAPZαA-517和pGAPZαB-521经线性化后,电击法转化毕赤酵母SMD1168菌株,构建分泌型表达SVCV糖蛋白的重组酵母菌株。酵母菌落PCR法检测表明,已成功构建分泌表达SVCV糖蛋白的酵母基因工程菌株,斑点印迹法进一步分析表明有目的蛋白的成功表达。     

传染性鲑鱼贫血症病毒实时荧光环介导等温扩增检测方法的建立

根据ISAV的基因保守序列,利用LAMP Designer软件设计了6条引物,采用新型的环介导等温扩增设备进行扩增和检测,优化了反应条件,分析了所建立方法的特异性和灵敏度,并与RT-PCR和实时荧光RT-PCR进行比较。研究表明,该方法最适反应温度为64℃,反应10 min就可以观察到明显的扩增。该方法灵敏度高,检测限为78.4 fg RNA,比常规RT-PCR灵敏度高100倍,与实时荧光定量RT-PCR灵敏度相当;特异性好,与传染性胰腺坏死病毒(IPNV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、出血性败血症病毒(VHSV)、鱼类病毒性神经坏死病病毒(VNNV)、鱼腹水病毒(YAV)等14种主要鱼类病毒没有交叉反应。结果表明,本研究建立了ISAV的实时荧光环介导等温扩增检测方法,实验能对整个扩增过程进行实时监测,提高检测灵敏度的同时,防止由于开盖跑电泳或加染料而导致的污染。     

鱼类病毒性出血性败血症病毒核蛋白基因的原核表达

通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)获得编码病毒性出血性败血症病毒(Viral hemorrhagic septicemia virus,VHSV)核蛋白基因,将其克隆至原核表达载体pET28a,并在E.coli BL21(DE3)中得到表达,用SDS-PAGE与Western-blot对表达产物进行鉴定。结果表明,通过RT-PCR扩增获得长度为1 221bp核蛋白基因片段,诱导表达重组质粒pET28a-N,经SDS-PAGE检测,IPTG终浓度为1mmol/L时,诱导5h蛋白表达量最高,获得的目的蛋白大小与N蛋白的预测分子质量一致,约为48ku。诱导后的菌液进行超声波破碎后,将沉淀和上清分别用于SDS-PAGE电泳,结果表明目的蛋白主要以包涵体的形式存在。表达蛋白经过复性、纯化,得到了较高纯度的可溶性蛋白。经Western-blot检测表明,该表达产物能被羊抗VHSV阳性血清特异性识别。