猪瘟兔化弱毒株E~(rns)基因的克隆及序列分析

从兔脾组织中提取猪瘟病毒兔化弱毒株RNA,利用RT-PCR技术,扩增了猪瘟兔化弱毒的第一个囊膜糖蛋白基因Erns,并对其进行了序列分析。核苷酸序列比较发现,CSFV与Brescia株和GPE-株的同源性为94.6 %,与石门毒株和Alfort/A19株的同源性为95.0 %,与ALD株的同源性为95.4 %。根据核苷酸序列推导出氨基酸序列,并进行氨基酸序列同源性比较,结果表明,CSFV与Alfort/A19株和ALD株的同源性为93.8 %,与GPE-株的同源性为93.0 %,与石门毒株和Brescia株的同源性分别为94.7 %和95.2 %。 rns     

猪源口蹄疫病毒China99/S株基因组全长cDNA的构建及其感染性鉴定

提取猪源FMDV China99/S组织样品总RNA,利用设计的引物对,分段进行扩增,获得覆盖全基因组的4个重叠片段(A、B、C和E),然后用BsmB Ⅰ/Xma Ⅰ、Xma Ⅰ/BamH Ⅰ、BamH Ⅰ/Not Ⅰ、Hpa Ⅰ/Kpn Ⅰ分别双酶切A、B、E、C,并纯化回收,依次定向克隆到带有聚合酶Ⅰ的pPⅠ cDNA3.1(+)转录载体内,最终得到重组质粒pP1-FMDVcDNA3.1(+);然后对该质粒进行序列测定.结果表明,China99/S株基因组全基因组序列长8 116 nt(含Poly(C)和Poly(A)片段),其中5′NCR长1 064 nt,蛋白编码区核苷酸序列为6 318 nt,编码1个由2 106个氨基酸组成的聚合蛋白,3′NCR长93 nt,其后是含有38个A碱基的Poly(A)尾.其中5′NCR引入含41个C的Poly(C)片段.将pPⅠ FMDVcDNA3.1(+)用脂质体转染法导入BHK-21细胞,传代培养,可以观察到典型的FMDV致细胞病变效应.利用CPE、电镜、动物试验、RT-PCR和序列测定进行检测,结果表明,从该系统中成功拯救出具有感染性的猪源FMDV China99/S株重组病毒.     

绵羊呼吸道病原菌分离及药敏试验

近年来迫于环境和资源的双重压力,我国肉羊饲养由牧区向农区和南方草山草坡地区扩展转移已成必然之势.由于饲养环境和养殖方式的改变,羊病发生的风险将会大增,呼吸系统疾病上升并已成为制约肉羊规模化饲养进程的主要因素之一[1].随着抗菌药物在集约化羊场的广泛使用,不可避免地导致细菌对药物产生耐药性,这一现实无疑增加了羊场疫病防控的难度.为了解和掌握规模化羊场呼吸道细菌感染情况以及耐药程度,为指导临床用药提供依据,本试验对甘肃某规模化羊场发生的呼吸系统疾病进行了细菌分离培养、药敏试验和临床效果观察.     

猪繁殖与呼吸综合征·猪瘟和猪圆环病毒Ⅱ型混合感染的鉴定及病原特性分析(英文)

[目的]鉴定由猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)引发的猪疫病并进行病原特性分析。[方法]采集湖南湘潭(编号为HN/XT)发病猪的组织和脏器,进行DNA、RNA提取,然后进行PCR扩增、测序;同时采用细胞分离技术进行毒株的分离、鉴定。CSFV和PCV2的鉴定:间接免疫荧光法操作。PRRSV的鉴定:由于PRRSV可致Marc-145细胞发生病变,故可由细胞病变与否作出初步鉴定。[结果]测序分析结果表明,CSFV、PRRSV和PCV2与目前流行毒序列及GenBank下载序列氨基酸同源性分别为90%、94%和96%左右,可见该次猪病疫情至少是由CSFV、PRRSV和PCV23种病毒混合感染引起。[结论]该研究可对当前危害养猪业混合感染疾病的流行病学研究和净化控制提供数据。     

口蹄疫病毒突破宿主细胞天然免疫应答的机制

口蹄疫病毒(FMDV)感染宿主必须突破天然免疫应答,细胞天然免疫应答是宿主天然免疫应答最关键的组成部分。FMDV只有突破宿主细胞天然免疫才能在细胞内生长、繁殖和传播,为达到这一目的要利用多种途径来抗衡甚至破坏宿主细胞天然免疫应答。然而FMDV突破宿主细胞天然免疫应答的机制至今尚不十分清楚,深入了解FMDV突破宿主细胞天然免疫应答机制,有助于人们进一步认知FMDV致病机理,开发新型疫苗和生物治疗药物以应对口蹄疫的暴发和流行。本文从FMDV感染后宿主细胞的转录和翻译系统,病毒抗原性多肽的递呈、天然免疫细胞功能损伤和免疫病理作用四个方面对FMDV突破宿主细胞天然免疫的机制作以综述。     

家畜布鲁氏菌BP26基因的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

利用原核表达的布鲁氏菌BP26蛋白作为标准抗原蛋白,建立布鲁氏菌病抗体检测方法。本试验从布鲁氏菌S2疫苗株通过PCR扩增获得BP26基因,构建融合表达质粒pET-28a-BP26后并转化BL21宿主菌,IPTG诱导表达,应用Western blot鉴定表达产物,并以纯化的重组蛋白作为包被抗原,通过优化反应条件,建立布鲁氏菌病抗体ELISA检测方法。结果表明,通过反应条件优化确定抗原的适宜包被浓度为5μg/mL,血清适宜稀释度为1∶20,二抗的适宜工作浓度为1∶20 000;通过敏感性试验结果表明,当血清稀释至1∶1 280时,仍检测为阳性;通过批间、批内重复性试验,变异系数均小于10%,表明本检测方法具有较高的重复性。用该方法对100份临床样本进行检测,并与试管凝集试验(SAT)进行相符性验证,符合率为94%,为布鲁氏菌病临床血清抗体检测及流行病学调查提供了技术手段。     

口蹄疫病毒OT株的全基因组序列测定及比较分析

参考GenBank上已发表的口蹄疫病毒(FMDV)全长基因组序列,设计了覆盖基因组全长的数对引物,通过RT-PCR方法对口蹄疫病毒OT株进行分段克隆及序列测定.结果表明不含poly(C)序列的OT株基因组全序列长8 142 nt,开放读码框(ORF)长6 969 nt、编码2 322 aa,5'UTR长1 004 nt,3'UTR长93 nt,3'UTR之后为23nt的poly(A)尾巴.应用分子生物学软件将OT株与FMDV其它参考毒株进行序列比对,并对其基因特征进行分析.结果显示,OT株的假结节(Pseudoknots)从第415-499位连续缺失85 nt,但是其3A基因却未发生碱基的缺失.其VP1基因的核苷酸同源性与O/Akesu58、OMⅢ两株最高,但OT株在进化时间上要比O/Akesu58、OMIII早很多,其毒株起源和遗传衍化关系还需要进一步的关注.     

多重PCR方法快速鉴别猪伪狂犬疫苗毒和野毒

根据Genbank中PRV的gB、gE、TK基因序列设计并合成引物,对样品中PRVDNA进行多重PCR扩增及反应条件优化,得到与设计相符合的3条特异性条带,分别为427bp（gB）、298bp（gE）和208bp（TK）。用这3对引物对四种伪狂犬疫苗样品DNA进行多次多重PCR扩增,其中1种疫苗得到与设计相符的1条特异性条带,其余为2条。该结果表明,此检测方法敏感度较高,适用于科学研究、临床诊断以及流行病学调查,对根除伪狂犬病具有重要意义。     

猪水泡病病毒5''和3''非编码区一级和二级结构分析

应用RT-PCR技术,用特异性引物扩增出SVDV HK’70 5’和3’非编码区,并将目的片段连接于pMD18-T载体,转化JM109感受态细胞。重组质粒经双酶切、PCR鉴定后测序。核苷酸序列比较结果表明,SVDV HK’70 5’非编码区与参考毒株SVDV J1’73、SVDV H/3’76核苷酸的差异率分别为1.6％、1.9％;SVDV HK’70 3-NCR与参考毒株SVDV J1’73、SVDV H/3’76核苷酸的差异率分别为1.0％、1.0％。应用计算机软件对3个SVDV毒株非编码区的二级结构进行预测,结果表明,SVDV HK’70 5’非编码IX-"级结构中存在13个结构域,SVDV J1’73 5’非编码区二级结构中存在9个结构域,SVDV H/3’76 5’非编码区二级结构中存在10个结构域;SVDV HK’70 3’非编码区二级结构中存在3个结构域,且与其他的两个毒株SVDV J1’73、SVDV H/3’76基本相同。     

口蹄疫病毒P1 2A和3C基因重组逆转录病毒表达载体的构建

以A型口蹄疫病毒（FMDV）AV88（L）和XJ99株的P12X基因和AV88（L）3C基因的阳性克隆质粒为模板，用PCR扩增各基因片段，酶切后分步定向亚克隆至逆转录病毒表达载体pBABE-puro上经PCR、酶切鉴定及测序。结果表明，获得了2个含不同RGD基序的A型FMDV衣壳蛋白和蛋白酶基因的重组逆转录病毒表达载体pBABE-AV88（L）P1 2X3C和pBABE-XJ99 P1 2X3C，为研究安全、高效、低成本的FMDV空衣壳亚单位疫苗奠定了基础。