口蹄疫病毒Asial/JS/China/2005株基因组全长感染性克隆的构建

利用长距离RT-PCR技术扩增病毒基因组3'端覆盖口蹄疫病毒Asial/JS/China/2005株近全长的3个片段(共约7.5 kb),并利用单一酶切位点将其分别克隆到pBlueseriptSK+载体上.利用融合PCR扩增到基因组5'端含有15个C碱基的基因片段(约700 bp),并将其连接至pGEM-T载体.最后将这4个片段的阳性克隆装配至剔除T7启动子的低拷贝载体pcDNA3.1/Zeo(+)中构建该病毒株的全长cDNA克隆.以构建的FMDV Asial/JS/China/2005株全长cDNA为模板,使用TTRNA聚合酶在体外转录得到病毒RNA,通过脂质体将其导入BHK细胞获得拯救病毒.对收获的病毒分别用RT-PCR、间接免疫荧光、电子显微镜观察和乳鼠致病性分析结果证实,通过体外转录获得了具有感染性的口蹄疫病毒.该株感染性克隆的构建为深入研究口蹄疫病毒的致病机制及研制新型疫苗等奠定了基础.     

猪瘟病毒E2基因抗原结构域A、B、C、D区在大肠杆菌中的表达

采用PCR技术扩增出猪瘟病毒E2基因抗原结构域A、B、C、D区并克隆于PGEM-T easy载体上，测序结果表明插入的为猪瘟病毒E2基因抗原结构域，切出目的基因，将目的基因克隆到表达质粒pProEX—HTb中，获得重组质粒经PCR、酶切和序列分析鉴定E2基因抗原结构域插入的位置、大小和读码框均正确，SDS—PAGE检测表明受体菌经IPTG诱导后能表达E2基因抗原结构域蛋白，Westernblot检测表明受体菌诱导表达E2基因抗原结构域蛋白可与猪瘟阳性血清发生特异性反应。     

逆转录病毒载体介导的口蹄疫病毒衣壳前体基因和绿色荧光蛋白基因在BHK-21细胞中的表达

为建立逆转录病毒载体介导的口蹄疫病毒衣壳前体蛋白哺乳动物细胞表达体系,将口蹄疫病毒（FMDV）衣壳前体基因（P1）和绿色荧光蛋白基因（EGFP）依次插入逆转录病毒载体pBABEpuro构建重组逆转录病毒载体pBABEpuro-P1-2A-EGFP。将重组逆转录病毒载体和pVSV-G质粒载体共转染GP2-293包装细胞,用产生的重组逆转录病毒感染幼仓鼠肾细胞（BHK-21）。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,用嘌呤霉素筛选抗性细胞,间接免疫荧光方法检测细胞中FMDV衣壳前体蛋白的表达。结果表明,重组逆转录病毒载体pBABEpuro-P1-2A-EGFP构建正确,绿色荧光蛋白和FMDV衣壳前体蛋白在细胞中能稳定表达。FMDV衣壳前体蛋白基因细胞表达体系的成功建立为进一步开展口蹄疫亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

猪瘟病毒NS3蛋白在真核细胞中的表达与定位

为研究与猪瘟病毒NS3蛋白相互作用的宿主细胞蛋白,采用PCR方法获得NS3基因,将其定向克隆至pCMV-Myc真核表达载体,经酶切鉴定及序列测定分析,将鉴定为阳性重组表达质粒命名为pMycNS3。采用脂质体介导法将pMyc-NS3转染至PK-15细胞和293T细胞,Western blot和间接免疫荧光检测目的蛋白的表达。结果表明,成功构建重组表达质粒pMyc-NS3,Western blot表明,NS3蛋白在PK-15细胞和293T细胞中均得到表达,NS3在PK-15和293T细胞质中呈弥散性分布。说明,成功构建的猪瘟病毒NS3基因与Myc融合表达质粒,为验证NS3蛋白与宿主细胞蛋白相互作用奠定基础。     

O型口蹄疫病毒免疫层析试纸条检测方法的建立

为建立一种快速、准确检测O型口蹄疫病毒（FMDV）抗原的胶体金免疫层析方法,将兔、豚鼠抗O型FM-DV多抗用DEAE-Sephose层析柱纯化。胶体金标记O型豚鼠口蹄疫抗体,形成金标探针并将其喷涂于玻璃纤维上。兔抗O型FMDV抗体和羊抗豚鼠IgG分别标记于硝酸纤维素膜上作为检测带和质控带,各部件按顺序装配形成快速诊断试纸条。如果待检样品中含有O型FMDV,它将与玻璃纤维上的胶体金探针和兔抗O型FMDV抗体形成夹心复合物,并在检测带被固定,沉集反应形成肉眼可见的红色条带。在田间试验中,53份试验样本分别用试纸条和反向间接血凝试验进行检测,2种方法的阳性率分别为95.45%和90.91%。评价试验证实,本研究建立的胶体金免疫层析方法简便、快速,具有良好的特异性和敏感性,非常适于基层兽医实验室诊断时使用。     

PCV2衣壳蛋白肽段的表达及其血清抗体间接ELISA检测方法

利用可溶性重组PCV2-Cap蛋白肽段为抗原,建立PCV2血清抗体间接ELISA诊断方法(rhcap-ELISA)。将PCV2cap基因中含主要表位的片段克隆到表达载体pGEX-6p-1上,转化E.coli,降低诱导温度至18℃诱导,获得大小为34 ku的可溶性融合蛋白。Western blotting试验证实该融合蛋白具有很强的免疫学活性,通过亲和层析柱对可溶性蛋白进行纯化。用融合表达的可溶性蛋白肽段作为抗原,建立猪圆环病毒(PCV2)血清抗体间接ELISA诊断方法。该方法的交叉反应结果表明,重组抗原与PRRSV、CSF、PPV和PRV阳性血清之间不存在交叉反应;用rhcap-ELISA和商品化的同类试剂盒(PCV2-Ab-Kit)检测137送检血清样品,2种试剂盒的阳性检测率分别为79.56%和83.21%。因此,rhcap-ELISA猪圆环病毒抗体检测试剂盒具有良好的敏感性和特异性,适合于在大规模的PCV2血清抗体的检测工作中使用。     

羊口疮病毒疫苗株与野毒株VIL-10基因的比较分析

试验旨在比较分析羊口疮病毒（orf virus,ORFV）VIL-10基因在疫苗株和野毒株之间的差异特征。参照GenBank中公布的ORFV NZ2株的VIL-10基因序列设计并合成1对特异性引物,分别以疫苗株和野毒株提取的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增ORFV的VIL-10基因全序列并进行测序,应用生物信息学相关软件分析基因的核苷酸、氨基酸变异情况及蛋白结构。结果显示,本试验测定的疫苗株和野毒株VIL-10基因核苷酸序列同源性为94.4%,差异主要是单个碱基的突变,其中疫苗株在132~134 bp核苷酸序列出现缺失;氨基酸序列同源性为92.5%,出现了15个氨基酸位点的突变,其中疫苗株第42位氨基酸天冬酰胺出现缺失;蛋白质在一级结构及理化性质、二级结构、三级结构、抗原表位参数及有无信号肽之间均存在一定程度的差异,而疫苗株和野毒株编码的蛋白质均无跨膜结构域。系统进化树分析结果表明,本试验测定的野毒株与疫苗株属于不同分支,遗传关系较远。研究结果提示,野毒株与疫苗株的VIL-10基因发生较明显的变异,这些变异可能与ORFV疫苗株的毒力致弱有关。     

猪水疱病病毒致病和免疫的分子基础

猪水泡病病毒（Swinevesiculardiseasevirus,SVDV）属于小RNA病毒科（Picornaviriclae）肠道病毒属（Enterovirus）,其抗原特性与柯萨奇病毒B5（CoxsackievirusB5,CVB5）关系密切,被认为是CVB5的一个猪变种或亚种。SVDV只有一个血清型,但对其分离株进行系统发生分析可进一步分为4个抗原群或基因群。     

蛋白质组学样品处理方法研究进展

蛋白质组学研究已经成为后基因组时代的研究热点,是生命科学研究领域又一个新的突破口。以双向凝胶电泳为主的蛋白质分离技术以及基于生物质谱的蛋白质鉴定技术是目前该领域主要研究技术手段。在双向凝胶电泳蛋白分离和蛋白质谱鉴定中,样品处理影响甚至决定着蛋白分离效果和鉴定结果。因此有效的样品处理技术是获得真实、可靠实验数据的关键,在比较蛋白质组学研究中样品处理尤为重要。本文针对双向电泳前的蛋白质样品处理及质谱鉴定前的样品处理技术的研究进展作以综述。