柑橘黄龙病菌亚洲种菌毛装配蛋白基因(PAP)序列分析、原核表达及抗血清制备

菌毛装配蛋白(Flp pilus assembly protein, PAP)是一种分泌蛋白,参与细菌菌毛的组装,表达量高。本研究以感染柑橘黄龙病的海南琼海市绿橙叶片为材料提取总DNA,用其菌毛装配蛋白基因(PAP)的特异引物进行PCR扩增,获得该基因的目的片段,序列分析表明海南琼海柑橘黄龙病菌PAP基因与柑橘黄龙病菌亚洲种(GenBank登录号:CP001677.5)PAP基因序列一致。功能预测表明它含有两个与分泌功能相关的CpaC和Secretin结构域。PCR产物通过EcoRⅤ和XhoⅠ双酶切构建重组载体pET32a-PAP。将pET32a-PAP载体转化BL21(DE3)大肠杆菌,经终浓度为1 mmoL/L IPTG诱导,目的蛋白主要以包涵体形式表达。目的蛋白经Ni~(2+)-NTA层析柱纯化,并作为抗原腹腔免疫小白鼠,获得效价在1∶500～1∶1 000的多克隆抗血清。Western blot分析表明,PAP多克隆抗血清特异性强;以田间样品总蛋白做抗原时,能特异性检测染病样品。本研究为PAP蛋白功能研究和开发柑橘黄龙病菌的蛋白检测产品提供研究基础。     

对虾白斑综合症病毒的分子生物学研究进展

对虾白斑综合症病毒(wkite spot syndrome virus,WSSV)又称对虾白斑杆状病毒(white spot bacilliform virus WSBV),是对全球对虾养殖业危害最大的病原之一。该病毒分子量较大、结构特异,是已知动物病毒中最大的病毒。自1992年以来,各国学者对WSSV进行研究。由于他们研究的方法及研究的侧重点不同,对该病毒命名各异。陈秀男(1993)称之为白斑综合症杆状病毒(WSBV);荷兰Wongteerasupaya(1995)称其为系统外胚层和中胚层杆状病毒(SEMBV);     

广东烟草花叶病毒的提纯,鉴定及外壳蛋白基因扩增

从广东烟草病株叶片中提纯获得一种杆状病毒,用几种血清学方法测定该病毒和烟草花叶病毒有血清学关系,SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳表明该病毒外壳蛋白由一种分子量为17500道尔顿的亚基构成。根据粒体形态,血清学及病毒生化特性,该病毒被鉴定为烟草花叶病毒。从提纯病毒提取RNA,反转录合成cDNA,用人工合成的两段DNA引物通过聚合酶链式反应扩增获得480bp的外壳蛋白基因片断。     

多聚酶链式反应检测海南槟榔黄化病

应用多聚酶链式反应(PCR)技术检测海南槟榔黄化病。结果表明：槟榔黄化型黄化病病株样品分别用2组植原体(Phytoplasmas)通用引物（R16mF／R16mR2、R16mF2／R16R2和1067／1068)测定，均出现特异的Phytoplasmas DNA谱带，呈阳性结果；而健康植株相应组织样品(对照)和其它样品则均未出现上述谱带，呈阴性反应。因此，黄化型的槟榔黄化病病株组织内存在植原体，植原体是导致槟榔发生黄化型黄化病的病原菌。     

植物抗病基因特征和抗病分子育种策略

阐述已克隆的抗病基因特征以及植物抗病的可能内在机制,提出了应用基因工程进行抗病育种时应注意的问题及解决方法。     

辣椒脉斑驳病毒文昌分离物基因组测序及分析

辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle virus,ChiVMV）近年来严重危害海南黄灯笼辣椒的产量,开展针对该病毒的研究以求达到对其有效防控迫在眉睫。本研究分7段克隆了ChiVMV文昌分离物（ChiVMV Wenchang isolate,ChiVMV-WC）的基因组。分段克隆的测序结果通过拼接,共获得ChiVMV-WC基因组9717个核苷酸（nt）序列（GenBank登录号：GQ981316）。在核苷酸序列的第164位～第9270位存在一个大的开放阅读框（ORF）,编码一个多聚蛋白（分子量为350.44kD）。近年来被证实的马铃薯Y病毒科的一个新的ORF（pretty interesting potyviridae ORF,PIPO）存在于ChiVMV-WC基因组核苷酸序列的第2892位～第3110位,编码一个由72个氨基酸聚合而成的多肽（分子量为8.26kD）。ChiVMV-WC与ChiVMV其它分离物的基因组核苷酸序列比较发现该病毒存在着较高的变异率。本研究通过与同属内病毒的同源性分析以及系统进化树分析,确定了ChiVMV-WC在生物进化史上的地位。     

香蕉条斑病毒ORF Ⅰ、ORF Ⅱ酵母双杂交系统诱饵质粒的构建及鉴定

以连接在pMD-18T载体上的香蕉条斑病毒（BSV）全基因组为模板,PCR扩增得到了带有Gateway R重组反应接头序列的香蕉条斑病毒ORFⅠ及ORFⅡ基因片段,经过BP、LR重组后,构建成带有目的片段的酵母双杂诱饵质粒pDEST32-O1及pDEST32-O2。将质粒转化E.coli DH5α感受态细胞,筛选序列和编码框均正确的重组质粒。将以上2种正确的重组质粒分别与用于构建诱饵质粒的pDEST22空质粒共转化酵母MaV203感受态细胞,利用营养缺陷培养基（SC-Leu-Trp）筛选转化子,并对转化子进行毒性鉴定、自激活鉴定以及3-AT抑制浓度鉴定。结果显示,2种转化子均生长正常,说明所构建的2个重组质粒表达蛋白对酵母无毒性作用,其在特异营养缺陷培养基（SC-Leu-Trp-Ura）中无法生长,不能产生自激活现象,3-AT抑制浓度分别为50、75 mmol/L。以上结果说明所构建的2种诱饵质粒均可用于后续酵母双杂工作,为BSV与宿主的蛋白互作奠定了基础。     

蛋白质工程及其应用前景

对蛋白质的生物学功能及其在人类经济生活中的作用，以及蛋白质研究的历史进程进行概述，并着重阐述了蛋白质工程学科的创立、发展及基本原理和内容，介绍其研究现状和应用前景。     

黄瓜花叶病毒NASBA检测技术的建立

 以香蕉花叶病病样为材料,初步建立了黄瓜花叶病毒核酸序列依赖性扩增(Nucleic acid sequence based amplifica-tion,NASBA)的检测技术。通过以香蕉叶片总RNA为模板,在黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)亚组ⅠRNA 2高保守区设计特异引物,进行NASBA反应,经5%琼脂糖凝胶电泳检测,阳性样品中出现了预期大小为310 bp的条带,而阴性和空白对照中均未出现。并对11份香蕉样品分别进行NASBA反应,并经过斑点杂交验证与RT-PCR检测比较,两者的检测结果一致,灵敏度相当,检出限量可达100 pg。     

香蕉束顶病毒Rep蛋白特性分析及纯化体系的建立

以香蕉束顶病毒海口分离物DNA1(Accession NO. FJ463042)的Rep蛋白为研究对象,利用生物信息学软件对该蛋白的理化性质、结构组成、信号肽、磷酸化、二级结构、三级结构与功能结构域等作了较为详细的分析与预测,并配置了相关纯化试剂。将含重组质粒pET32b-Rep的E.coli BL21(DE3),接种到LB液体培养基,在20℃、0.1 mmol/L IPTG条件诱导4 h,产生大量的可溶性重组蛋白,经AKTA Explorer 100系统亲和层析柱后,用不同梯度的Washing buffer洗脱杂蛋白并对各阶段产物进行12% SDS-PAGE分析,确定了100 mmol/L咪唑的Washing buffer洗脱浓度,最终获得大量高纯度的重组蛋白。以His*Tag Monoclonal Antibody为一抗,Western blot鉴定结果表明纯化重组蛋白即为His-Rep融合蛋白。该纯化体系的建立为研究BBTV Rep蛋白的结晶奠定了基础,也为今后ABTV、FBNYV、MVDV、PNYDV等病毒的相关复制蛋白纯化提供了重要数据。