红树叶蛋白质样品制备方法的比较及其双向电泳分析

采用水溶液提取法(磷酸盐缓冲液系统)、三氯乙酸-丙酮沉淀法和Phenol改良提取法,对红树叶进行蛋白质提取,并比较分析了这3种方法的蛋白质提取率、完整性、溶解性等。结果表明:水溶液提取法得到的是胶状沉淀,基本为多糖类物质,蛋白质含量很低;三氯乙酸-丙酮沉淀法提取的蛋白质纯度较高,但双向电泳背景最低,提取率较低,蛋白质的完整性差;Phenol改良提取法的蛋白质提取率高,约为三氯乙酸-丙酮法的10倍,双向电泳凝胶背景比三氯乙酸-丙酮沉淀法要深,蛋白质的完整性好,能够被电泳分离的蛋白质点是三氯乙酸-丙酮沉淀法的7倍左右。Phenol改良提取法在蛋白质的提取率以及完整性方面远远高于其他2种蛋白质提取方法。     

柑桔黄龙病菌亚洲种菌毛形成蛋白基因序列分析、原核表达及抗血清制备

柑桔黄龙病菌菌毛形成蛋白(pilus formation protein, 408)是一种丰度较高的分泌蛋白。以感染柑桔黄龙病(HLB)的海南琼海市绿橙叶片为材料提取总DNA,利用408基因的特异引物进行PCR扩增,获得该基因的目的片段。序列分析结果表明海南琼海黄龙病菌408基因与柑桔黄龙病菌亚洲种psy62株系 (GenBank登录号:CP001677.5)408基因序列一致。功能预测结果表明其含有一个与菌毛形成相关的N端结构域,以及C端含有两个高度保守的基序(Motif 1和Motif 2)。通过Eco R Ⅴ和Xho Ⅰ双酶切构建重组载体p ET32a-408并将其转化BL21(DE3)大肠杆菌。重组菌经终浓度为1 mmoL/L IPTG诱导,目的蛋白主要以包涵体形式表达。目的蛋白经Ni2+-NTA层析柱纯化,并以此为抗原,腹腔免疫小白鼠,获得效价在1∶500～1∶10000的多克隆抗血清;Western blot进一步分析表明,408蛋白多克隆抗血清特异性强。研究结果为柑桔黄龙病菌408蛋白功能研究和柑桔黄龙病菌的蛋白检测产品开发提供重要科学依据。     

香蕉条斑病毒病研究进展

香蕉条斑病毒病是世界上分布最广泛的香蕉病毒病害之一。本文综述了香蕉条斑病毒病的主要特性、病毒检测技术及病害控制方法的研究进展。     

DNA的酯酶催化活性研究

应用萘酯坚固蓝反应显色法对ＤＮＡ的酯酶催化活性进行了研究。结果表明，辣椒ＤＮＡ、鲱鱼精ＤＮＡ具有分解萘酯的活性；反应混合物中鲱鱼精ＤＮＡ浓度为０．００３４ｍｇ／ｍＬ时，ＤＮＡ仍有分解萘酯的活性；随着ＤＮＡ浓度增加，ＤＮＡ的催化活性增强。６种寡聚核苷酸均具有催化萘酯水解的能力，但活性强弱不同；４种ｄＮＴＰ均不能催化萘酯水解。双链ＤＮＡ、单链ＤＮＡ的显色反应完全来自ＤＮＡ的催化萘酯水解反应     

对虾白斑综合症的研究进展

对虾白斑综合症由一种大型无包涵体杆状病毒引起，是对养虾业构成严重威胁的一种病毒。研究资料表明，世界各地的病毒分离物具有很高的同源性，该病目前尚无很好的防治方法。采用PCR方法检验亲虾，选择健康亲虾产卵、孵化，放养健康虾苗以及加强管理对提高养殖成功率有一定帮助。     

槟榔植原体膜蛋白基因的克隆及其抗血清制备

根据实验室测得的槟榔植原体膜蛋白基因(Ac Pmp)序列设计1对特异引物mp-FP/mp-RP,以病样槟榔总DNA为模板扩增该Ac Pmp的编码区并连接到p MD19T simple中间载体。将测序正确的阳性菌提取质粒p MD19T-Ac Pmp,经NcoⅠ和XhoⅠ双酶切后回收Ac Pmp片段,然后以正确的编码框连接到原核表达载体p ET32a(+),转化Escherichia coli BL21感受态细胞。含有p ET32a-Ac Pmp的BL21表达菌经IPTG诱导和SDS-PAGE分析表明,在30℃,0.1 mmol/L IPTG条件下诱导4 h,可产生部分可溶性的融合蛋白。利用Ni2+-NTA亲和层析柱法进行纯化并获得高纯度的可溶性融合蛋白。将纯化后的融合蛋白多次免疫家兔,取其抗血清,以融合蛋白(1∶10 000稀释)作抗原,间接ELISA法测定抗血清效价大于125 000。Western Blot杂交结果表明槟榔植原体膜蛋白抗血清能与融合蛋白特异性结合。     

甘蔗黄叶病毒实时荧光RT-PCR检测体系研究

甘蔗黄叶综合症(yellow leaf syndrome,YLS后称甘蔗黄叶病)是由甘蔗黄叶病毒(sugarcane yellow leaf virus,ScYLV)引起的一种重要的甘蔗病害,为更快、更准确地检测ScYLV,合成了一对特异性引物s-pf和s-pr,建立了运用SYBR Green I荧光染料法检测ScYLV的实时荧光RT-PCR体系,并对该体系的特异性、灵敏性和适用性进行了测试。结果表明:该检测体系能特异地检出ScYLV,对测试的高粱花叶病毒不能检出,灵敏度比常规PCR高100倍,适用性广。实时荧光RT-PCR检测整个过程完全闭管,无需PCR后处理且SYBR Green I荧光染料成本较低,适用于检测甘蔗体内含量较低的ScYLV病毒。     

ScYLV和SrMV的PCR引物优化设计

以甘蔗黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus,,ScYLV)和高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,,SrMV)为材料,运用DNAMAN、Primer Premier 5.0和Oligo6.0等软件设计PCR引物,,进行普通PCR、多重PCR、实时定量PCR反应,检验所设计引物的PCR扩增效率、特异性和有效性。归纳总结多种PCR反应中引物设计的一般性思路,提出启发性的方法,并将以上经验付诸实践检验;最后将研究思路概括为:针对性、实用性和一般性。     

番木瓜的PRSV接种及其组培苗的RT-PCR检测

随着番木瓜环斑病毒病的加重,对番木瓜进行PRSV病毒接种,是有效防治PRSV和番木瓜抗PRSV重要措施之一.根据GenBank上已有的PRSV-CP基因序列,设计1对特异引物PRSVCP3/PRSVCP4,同时根据EF183499、HQ424465和美国夏威夷PRSV-CP序列设计保守区特异性引物PRSVCP1/PRS...     

香蕉条斑病毒云南分离物ORFⅠ的原核表达及其抗血清制备

以连接在pMD-18T载体上的香蕉条斑病毒云南分离物(BSV)全基因组为模板,设计特异引物,PCR扩增获得ORFⅠ全长序列。目的片段及原核表达载体pET32(b)分别经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后,连接构建重组质粒pET32-ORFⅠ,将鉴定为正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,获得原核表达OFRⅠ工程菌。工程菌在28℃条件下,用浓度为0.1 mmol/L的IPTG诱导表达6 h,离心收集菌液并超声波破碎,获得以含目的肽段的可溶性蛋白为主的融合蛋白。将融合蛋白通过Ni2+-NTA亲和层析柱纯化后,得到纯度较高的融合蛋白。以此蛋白为抗原免疫家兔,获得特异抗血清,该抗血清的效价达1∶100 000,Western Blot验证表明,抗血清的特异性较强。本研究为BSV的快速检测以及BSV编码蛋白的功能研究奠定了基础。