环形泰勒虫感染细胞抑制性消减文库的构建及ESTs分析

【目的】环形泰勒虫（Theileria annulata）可以感染牛B淋巴细胞、树突状细胞和巨噬细胞,并可使被感染细胞发生转化,体外培养时可获得类似肿瘤样细胞的无限增殖能力。本研究通过构建环形泰勒虫转化和非转化宿主细胞抑制性消减文库,筛选环形泰勒虫裂殖体基因及转化细胞与宿主正常细胞之间的差异表达基因。【方法】以环形泰勒虫裂殖体转化细胞和非感染牛外周血单个核细胞（即非转化宿主细胞）为试验材料,提取总RNA和mRNA,反转录合成cDNA;然后分别作为tester和driver,进行抑制性消减杂交（SSH）,构建环形泰勒虫转化和非转化宿主细胞抑制性消减文库;对随机挑取的阳性克隆进行测序及生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR对文库部分差异基因进行验证。【结果】通过对文库454个阳性克隆进行测序,共获得了有效表达序列标签（ESTs）364条,大小主要分布在350-1 200 bp之间;将这些ESTs序列在GenBank中进行BLASTn网上序列比对,其匹配于192条基因序列;其中包括环形泰勒虫序列60条(11条为虫体蛋白酶基因序列、10条为膜蛋白基因序列、7条为假设蛋白基因序列、5条为凋亡相关虫体蛋白基因序列、5条为核糖体蛋白基因序列、4条为细胞周期蛋白基因序列、4条为虫体抗原基因序列和虫体其它基因序列14条)、牛基因序列131条（其中19条为肿瘤相关蛋白基因序列）和1条未知序列;其中已有功能注释的ESTs 285条,再将已知功能的ESTs通过WEGO软件从生物学过程（biological process）、细胞组成（cellular component）和分子功能（molecular function）3个部分进行GO聚类分析,结果表明,宿主细胞差异基因主要集中在细胞、细胞进程、结合、催化、代谢进程、生物调节等功能方面。另外,通过对部分环形泰勒虫裂殖体转化宿主细胞差异基因进行荧光定量PCR分析,结果表明,肿瘤相关基因HCLS1和SENP5在转化宿主细胞中转录水平分别是非感染牛PBMCs(非转化宿主细胞)的2.06和1.32倍。【结论】利用SSH技术,成功构建了环形泰勒虫感染宿主细胞的抑制性消减文库,筛选获得了转化宿主细胞和环形泰勒虫裂殖体的表达基因,并通过荧光定量PCR分析获得了2个可能参与宿主细胞转化的基因,为进步探索环形泰勒虫与宿主细胞相互作用的分子机制奠定了基础。     

卵形巴贝斯虫在长角血蜱饱血雌虫及其卵内的发育形态观察

 将实验培育的“清洁”长角血蜱饥饿成虫，饲喂在卵形巴贝斯虫单一种人工感染牛体上，俟雌虫饱血脱落后，置28℃、相对湿度90%的培育箱中培育产卵，并逐日解剖制片。对饱血雌虫血淋巴、肠管、唾液腺及其卵内卵形巴贝斯虫的发育形态进行了观察。结果在肠管中见到红细胞外裂殖子、圆环形、眼镜框形、出芽形、梨形、小圆形虫体和大裂殖子。在血淋巴中发现了未成熟大裂殖体、成熟大裂殖体和游离大裂殖子。卵巢中发育的虫体具多形性：圆环形、大小不同以及核的位置和数目不同的球形体、大裂殖子和梨形体。在卵中观察到核数目不同的球形体、长梭形和双核大裂殖子、小裂殖体和游离小裂殖子。本文是有关卵形巴贝斯虫在长角血蜱饱血雌虫血淋巴、肠管及卵内发育形态的首次报道。并首次发现卵形巴贝斯虫在其媒介蜱体内有裂殖体发育阶段。     

试验性羊泰勒虫病的病理学观察

对用羊泰勒虫单一种人工感染的试验羊进行了病理学观察。结果显示，试验羊的可视黏膜苍白，皮下脂肪胶样水肿，全身淋巴结、心、肝、脾、肺和肾均有不同程度肿胀；实质器官组织变化的主要特征为明显的增生和巨细胞结节形成；淋巴结的窦内皮与网状细胞明显增生，甚至形成团块和条索；淋巴与网状内皮细胞中可见到裂殖体；脾还可见到坏死结节；肾小球毛细血管内皮细胞和间质细胞也明显增生；肝窦内皮的增生特别明显，甚至形成细胞条索；与淋巴结、脾、肾一样，肝小叶内同样有巨细胞结节形成，在上述巨细胞结节中均可在细胞浆中发现裂殖体；大脑中主要表现血管内皮与小胶质细胞增生。     

长角血蜱卵cDNA表达文库的构建

 【目的】以长角血蜱卵为材料构建高质量的长角血蜱卵cDNA表达文库,为进一步筛选克隆目的基因奠定基础。【方法】在无RNA酶污染的环境下从长角血蜱卵中提取RNA,进而纯化mRNA,采取oligo（dT）引物合成双链cDNA,定向克隆到λSCREEN载体。用PhageMaker extract对其进行体外包装以形成完整的噬菌体,转染大肠杆菌ER1647,测定库容量。并用构建的cDNA文库克隆已知的长角血蜱促卵泡激素基因。【结果】所构建长角血蜱卵cDNA表达文库的基础库容量约为1.38×106 PFU,重组率为100%,扩增后文库的滴度为2×109 PFU•ml-1。获得了目的基因,其序列与GenBank中的长角血蜱促卵泡激素（DQ248886）的核苷酸序列的同源性为97.8%。【结论】成功构建了长角血蜱卵cDNA表达文库。     

一种牛源扇头蜱及其携带梨形虫种类鉴定

为了鉴定从汉中市牛体表采集到的蜱种类及其携带病原梨形虫(Piroplasma)的种类,在形态学初步观察的基础上,用PCR技术基于线粒体16SrDNA对蜱种类进行了分子鉴定,并基于梨形虫18S rRNA基因分别检测蜱体内携带巴贝斯虫属(Babesia)、泰勒虫属(Theileria)等病原情况.结果显示,所采集到的67只...     

基于经济效益视角下矿区土地复垦可行性实证研究--以神府矿区朱家沟和白泥塔煤矿为例

运用静态和动态相结合的经济分析方法,对陕西省神府矿区土地复垦从经济效益角度进行可行性实证研究分析。研究表明矿区被毁损土地通过有效复垦,在经济上可行,且生态效益和社会效益显著。在此基础上,提出对神府矿区土地复垦可行性的对策进行优化。     

18S rRNA序列差异在马梨形虫分类学中的应用

为揭示18S rRNA V4高变区在物种分类学的本质意义,及进一步阐述马泰勒虫(之前称马巴贝斯虫)的分类学地位,本试验参考马泰勒虫(DQ287951)和驽巴贝斯虫(FJ209026) 18S rRNA基因序列,在其V4高变区设计引物.将获得的片段克隆至pMD19-T进行测序,正确的结果与其他种梨形虫的相应序列进行分析.系统发生树结果显示,泰勒虫和巴贝斯虫处于明显的两个分支,而称之为马巴贝斯虫的物种和泰勒虫有着较为密切的关系,他们处于同一分支,其亲缘关系较巴贝斯虫更远.序列对齐分析表明,巴贝斯虫核苷酸序列相对于泰勒虫种序列存在多个位点的缺失和突变.而马巴贝斯虫和泰勒虫18S rRNA V4高变区核苷酸序列的相似程度较高,与巴贝斯虫在该序列上的差异较大.以上结果表明,泰勒虫种和巴贝斯虫种18S rRNA V4高变区核苷酸序列间的这种缺失和突变可作为泰勒虫和巴贝斯虫分类依据的本质因素之一.马巴贝斯虫应隶属于泰勒虫科,泰勒虫属.     

牛中华泰勒虫新种(梨形虫亚目:泰勒虫科)2.分子分类学研究

分离自我国甘肃中部地区土种黄牛的一种形态特异的泰勒虫，采用传统分类学研究鉴定为新种，被定名为中华泰勒虫（Theileria sinensis sp.nov）。又利用对泰勒虫属特异的PCR引物（92/93）对该种基因组DNA扩增，结果表明该种属泰勒虫属原虫确定无疑，并对代表虫种进化和分类的18S rRNA基因序列进行了测定，对已测出该基因1067bp长片断序列与基因库中9种巴贝斯虫，7种已知牛泰勒虫的相应序列进行比较、分，建立起系统发生树。树图表明，瑟氏泰勒虫和水牛泰勒虫的亲缘关系非常近， 中华泰勒虫与这两个种的亲缘关系较近，与附膜泰勒虫、小泰勒虫、环形泰勒虫、斑羚泰勒虫、突变泰勒虫差异较大。     

玉米淀粉改性UF树脂胶合高含水率木材工艺研究

用二元酸与玉米淀粉进行酯化反应,制成半酯化玉米淀粉悬浮液,对ＵＦ树脂进行改性、胶合含水率１６％￣１８％的单板生产的胶合板物理力学性能符合ＧＢ９８４６．１￣１２－８８的标准要求,同时使树脂水和性良好。便于清洗涂胶设备。     

蜱源蛋白酶及其应用前景

蜱源蛋白酶在蜱和蜱传播疾病的致病机制中发挥重要的生理功能,但对于定性的寄生原虫蛋白鬃酶来说了解得还不很透彻,为了进一步研究蜱源蛋白酶的功能及其特征,筛选出更有价值的蛋白酶基因作为抗蜱疫苗候选抗原基因,从已有的蜱源蛋白酶生理作用角度介绍了蜱源蛋白酶的重要性,提出了将来研究蜱蛋白酶要攻克的难点,为我国采用分子文库的方法筛选抗蜱疫苗候选抗原及研制化学药物提供资料.