竹鼠源产纤维素酶枯草芽孢杆菌的生物学特性研究及安全性初步评价

本试验旨在对竹鼠肠内容物中分离出的3株产纤维素酶枯草芽孢杆菌进行生物学特性研究和安全性评价。对3株受试菌进行生长曲线测定、抗生素敏感性试验、耐药基因检测、小鼠体内安全性试验以及耐酸、耐胆盐、自凝聚性、疏水性等特性测定。结果表明：(1) GL-4、GL-5、GL-8 3株受试菌均生长快,1.5 h即可进入对数生长期、5 h即可达到最大生长量;(2)抗逆性强：3株受试菌在pH2.5的条件下存活率均达到65%以上、在胆盐浓度0.3%和0.5%的环境下仍能继续存活增殖;(3)自凝聚及疏水能力好：孵育到24 h,3株菌的自凝聚率均达到85%以上,GL-5和GL-8的疏水率均高于40%;(4) 3株受试菌对大部分抗生素敏感,对小鼠无毒副作用。GL-4、GL-5、GL-8 3株受试菌均具有优良的生物学特性,且安全性好,可作为畜禽微生态制剂良好的益生菌候选菌株。     

广西巴马小型猪脂联素受体1和受体2 cDNA的克隆及序列分析

[目的]克隆并分析广西巴马小型猪脂联素受体1（AdipoR1）和脂联素受体2（AdipoR2）编码基因的cDNA全序列。[方法]利用RT-PCR法,以骨骼肌总RNA为模板,分别扩增AdipoR1和AdipoR2全长cDNA序列,纯化后连接pMD 18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆体,鉴定后测序,并与其他物种AdipoR1和AdipoR2 cDNA序列进行同源性比较。[结果]RT-PCR扩增得到大小与AdipoR1和AdipoR2基因编码序列大小相同的片段,片段长度为1 128和1 161 bp。同源性比较分析发现,广西巴马小型猪AdipoR1和AdipoR2cDNA序列与GenBank中已报道的家猪脂联素受体同源性分别高达99.8%、99.7%,分别有1处和3处发生了碱基错义突变。[结论]该试验成功克隆了广西巴马小型猪AdipoR1和AdipoR2基因的cDNA,为进一步研究AdipoR基因的生物功能及设计以AdipoR为靶标的新型药物奠定了基础。     

大白猪ZnT基因家族生物信息学分析及组织表达研究

【目的】 分析大白猪溶质载体30A （ZnT）基因家族成员的生物学特性,并检测其在猪不同组织中的表达水平,为研究ZnT基因家族调控锌的代谢提供科学依据。【方法】 使用多种生物信息学软件对猪ZnT基因家族10个成员（ZnT1~ZnT10）进行序列分析,包括基序、保守结构域、跨膜结构域、进化树、蛋白相互作用分析;使用实时荧光定量PCR方法检测ZnT基因家族在6月龄大白猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、卵巢、乳腺中的表达差异。【结果】 ZnT1~ZnT10基因定位到猪的8条染色体上,分子质量在41.61~85.30 ku之间;等电点介于6.27~9.30之间,其中ZnT6等电点最高为9.30,ZnT1等电点最低为6.27。ZnT基因家族中,除ZnT3外都属于稳定蛋白,除ZnT5、ZnT9外都含有6层跨膜结构域,除ZnT6、ZnT9外所含基序顺序均一致,Cation-efflux是ZnT基因家族共有的保守结构域。ZnT6与ZnT2、ZnT3、ZnT7、ZnT9蛋白关联程度最高,ZnT1与ZnT3蛋白关联程度最高,ZnT8与其他家族成员间关系较远。ZnT基因家族序列在哺乳动物进化过程中相对保守。ZnT基因家族的10个基因在大白猪肺脏中相对表达量较高,在心脏中相对表达量较低,除ZnT5、ZnT7、ZnT9外的ZnT基因家族的其他成员在肌肉中几乎不表达。【结论】 ZnT家族属于跨膜结构蛋白,所含基序顺序基本一致,Cation-efflux是ZnT基因家族共有的保守结构域。ZnT基因家族多数成员在大白猪肺脏中表达量最高,在心脏和肌肉中相对表达量较低。     

大白猪CDO1基因克隆、生物信息学分析及组织表达定位

【目的】克隆大白猪半胱氨酸双加氧酶1(cysteine dioxygenase type 1,CDO1)基因并进行生物信息学分析,检测CDO1基因在大白猪不同组织中的表达情况,并定位CDO1在乳腺中的位置,为进一步探究CDO1基因在乳腺发育过程中的调控作用提供依据。【方法】通过PCR扩增大白猪CDO1基因CDS全长序列,将CDO1基因序列与pMD18-T载体连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取单个阳性菌扩增培养,菌液通过PCR鉴定后测序,对测序结果进行不同物种间序列相似性比对及系统进化树构建;利用在线预测软件对CDO1蛋白进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR检测CDO1基因在大白猪不同组织中的表达水平;利用免疫组化方法检测CDO1蛋白在母猪乳腺中的定位。【结果】大白猪CDO1基因CDS区序列全长603 bp,编码200个氨基酸,家猪与大白猪CDO1基因核苷酸序列相似性最高。系统进化树结果显示,大白猪与家猪先聚为一类,且与猕猴亲缘关系较近。CDO1蛋白的分子质量为23.018 ku,等电点为5.98,不稳定系数为33.58(<40),为稳定亲水性蛋白,定位在胞浆内,存在...     

猪GHR基因两个SNPs位点多态性与生长性状的关联分析

[目的]探讨猪GHR基因两个SNPs位点多态性与其生长性状的相关性,为保护广西巴马小型猪的遗传资源及推进猪分子标记辅助育种技术的发展奠定基础.[方法]采用PCR-RFLP和错配PCR-RFLP(CRS-PCR-RFLP)检测巴马小型猪×长白猪杂交F2代(简称巴×长F2代)资源家系中猪GHR基因G1248A和A1801G两个SNPs位点的多态性,并对其相关生长性状进行关联分析.[结果]猪GHR基因G1248A和A1801G两个SNPs位点在巴×长F2代资源家系中均表现出AA、AG和GG 3种基因型.G1248A位点对巴×长F2代生长性状的影响表现为:除2月龄GG基因型个体的胸围尺寸显著大于AA、AG基因型个体(P<0.05,下同),4月龄GG基因型个体的体重显著高于AA、AG基因型个体外,其他月龄的相关生长性状在不同基因型个体间差异均不显著(P>0.05,下同).A1801G位点对巴×长F2代生长性状的影响表现为:除1和6月龄GG基因型个体的体高显著低于AA、AG基因型个体,3和6月龄GG基因型个体的胸围尺寸显著大于AA、AG基因型个体外,其他月龄的相关生长性状在不同基因型个体间差异也不显著.[结论]猪GHR基因G1248A位点的G等位基因对个体体重、胸围有正选择作用,而A1801G位点的G等位基因对个体体高有负选择作用,对个体胸围有正选择作用,均可作为猪分子标记辅助育种的遗传选择标记.     

广西巴马小型猪PPARγ-2基因多态性与2型糖尿病易感性的相关性

[目的]探讨PPARγ-2基因多态性与广西巴马小型猪2型糖尿病易感性的关系。[方法]利用高糖高脂日粮饲喂24头广西巴马小型猪,利用PCR方法扩增PPARγ-2基因外显子2部分序列,测定其空腹血糖和胰岛素(INS)含量并进行糖耐量试验。[结果]克隆的PPARγ-2基因外显子2部分序列存在1处SNP位点(19813A/G),有AG(7头)和AA(17头)2种基因型。AG型广西巴马小型猪的空腹胰岛素含量和糖耐量试验中60 min血糖值显著高于AA型(P0.05),而AG型广西巴马小型猪2型糖尿病发生率(71.4%)明显高于AA型(5.9%)。[结论]广西巴马小型猪PPARγ-2基因外显子2的19813A/G多态性与2型糖尿病易感性有关。     

广西三黄鸡PPARγ谨因克隆及实时荧光定量PCR的建立

【目的】克隆广西三黄鸡过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）基因,建立该基因的实时荧光定量PCR,为后续开展广西三黄鸡PPARγ基因组织表达谱及品种间表达差异研究奠定基础。【方法】根据GenBank已公布的鸡PPARγ基因序列保守区域,用Oligo6．0软件设计合成1对引物,以广西三黄鸡脂肪总RNA为模板,用RT-PCR从广西三黄鸡克隆PPARγ基因。以携带PPARγ基因片段的重组质粒为标准品,建立基于SYBR GreenⅠ染料法的实时荧光定量PCR标准曲线。【结果】广西三黄鸡PPARγ基因的编码区序列（CDS）长1428bp,编码475个氨基酸;与GenBank已公布的鸡PPARγ基因（AF163811）参考序列比对,其同源性为99．7％,存在4个位点碱基突变,但均为无义突变。广西三黄鸡PPARγ基因的实时荧光定量PCR标准曲线方程为：y=-3．568x＋28．50,扩增效率为1．907,实时荧光定量PCR扩增产物的溶解曲线峰单一。【结论】鸡PPARγ基因在进化中比较保守;建立的广西三黄鸡PPARγ基因实时荧光定量PCR是可行的。     

3个不同群体罗氏沼虾线粒体16SrRNA基因序列分析及遗传差异

利用PCR技术扩增获得罗氏沼虾线粒体16SrRNA基因的部分片段,通过序列测定和用限制性内切酶MboI、AluI和TaqI分别对上述PCR产物进行限制性片段长度多态分析(RFLP),分析了取自缅甸引进种子代、广西养殖群体及江苏养殖群体3个不同群体罗氏沼虾的遗传差异。结果表明:在3个群体间序列同源性对比无变异,PCR-RFLP未发现有片段多态性,3个群体间不存在遗传结构差异。可能表明这3个群体的罗氏沼虾起源同一个种群,且分化较低。     

广西巴马小型猪MCP-1基因克隆及序列分析

[目的]研究广西巴马小型猪单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）基因CDs区的序列特点,为建立广西巴马小型猪动脉粥样硬化模型及揭示动脉粥样硬化的发生、发展机理提供理论依据.[方法]从广西巴马小型猪动脉血管组织中扩增MCP-1基因CDs区全长序列,与人类及其他易建立动脉粥样硬化模型动物的序列进行比对分析,并预测其蛋白质信号肽位点及结构域.[结果]广西巴马小型猪MCP-1基因CDs区全长300 bp,编码99个氨基酸;与人类MCP-1基因CDs区（S71513.1）的同源性最高,为84.4％.广西巴马小型猪MCP-1蛋白的前23位氨基酸为信号肽,后76位氨基酸为成熟肽,等电点（pI）9.51,蛋白质分子量10976.04 kDa,信号肽位置有一段跨膜结构;广西巴马小型猪与人类MCP-1蛋白在形成二级结构时,保守半胱氨酸参与形成二硫键的位置一致,分别在第11、12、36和52号（除信号肽片段）位上排列为Cys-Cys,且是第11号位与第36号位形成二硫键,第12号位与第52号位形成二硫键.[结论]以广西巴马小型猪构建动脉粥样硬化模型时,MCP-1基因表达量可作为判断动脉血管疾病的一个辅助指标.     

巴马香猪VRTN基因克隆、表达及其多态性与繁殖性状的关联分析

旨在研究VRTN（vertebrae development homolog）基因在巴马香猪群体中的编码区序列特征、组织表达情况、脊椎数性状因果突变位点ins291的等位基因频率及其与乳头数和产仔数性状的关联。本研究采集3头0日龄巴马香猪组织,利用cDNA克隆技术获得VRTN基因编码区全长序列并进行生物信息学分析,利用荧光定量PCR技术检测VRTN在心、肝、脾、肺、肾、背最长肌和皮下脂肪组织中的表达情况;采集279头经产巴马香猪母猪血液,检测ins291位点在该群体中的频率分布,并与乳头数、产仔数性状进行关联分析。结果表明,巴马香猪VRTN基因编码区全长2 097 bp,其编码的氨基酸序列在不同物种间存在大量保守区域;VRTN基因编码698个氨基酸,预测为亲水性蛋白质,存在1个螺旋转角螺旋域超家族结构功能区、2个低复杂度区域和2个内部重复结构,并与核受体辅抑制子1（NR6A1）、果蝇同源框基因Prospero的脊椎动物同源蛋白2（PROX2）和富亮氨酸重复序列74亚基（LRRC74A）等蛋白具有相互作用;VRTN基因在0日龄巴马香猪各组织中均有表达,其中在背最长肌组织中表达量最高;巴马香猪保种群体中VRTN基因有利突变位点ins291的等位基因频率为21.15%,不同基因型个体之间平均产仔数、总乳头数、左侧乳头数、右侧乳头数和单侧最大乳头数性状均无显著差异（P>0.05）,但纯合突变型（ins/ins）个体的乳头数性状均高于其他基因型个体。结果提示,在巴马香猪产业化生产中可通过分子育种手段提高VRTN ins291有利等位基因频率,但不影响其产仔数性状。