陆川猪GPR1基因真核表达载体构建及组织表达谱分析

试验旨在构建陆川猪G蛋白偶联受体1（G protein-coupled receptor 1，GPR1）基因真核表达载体，并对其组织表达谱进行分析。采用RT-PCR技术从10周龄陆川猪皮下脂肪组织中扩增出GPR1基因CDS区后，使用常规分子克隆手段构建含GPR1基因片段的真核表达载体pEGFP-N1-GPR1，利用双酶切和测序对重组质粒pEGFP-N1-GPR1进行鉴定，并以脂质体法将重组质粒转染3T3-L1细胞24 h后观察细胞荧光表达情况。收集所转染3T3-L1细胞并提取其总RNA，实时荧光定量PCR进一步检测GPR1真核表达载体表达情况；提取6头10周龄陆川猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、皮下脂肪总RNA，实时荧光定量PCR检测GPR1基因mRNA在陆川猪各组织中的表达量。结果表明，陆川猪GPR1基因CDS全长1 068 bp，成功将其连接至pEGFP-N1真核表达载体，重组表达载体pEGFP-N1-GPR1质粒和空载pEGFP-N1质粒所转染3T3-L1细胞均能表现出绿色荧光，且空白对照组并未表现出绿色荧光。实时荧光定量PCR结果证实，GPR1基因在重组质粒试验组的表达量极显著高于空载质粒组（P<0.01）。GPR1基因在10周龄陆川猪肝脏中表达量最高，在心脏、脾脏、肺脏、肾脏、皮下脂肪中均有表达，在背最长肌中几乎不表达。本试验成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-GPR1，并获得了GPR1基因组织表达谱，为进一步研究GPR1基因对陆川猪脂肪沉积的影响提供参考。     

大鼠胰岛素Ⅱ基因启动子克隆与功能验证

【目的】克隆大鼠胰岛素Ⅱ基因启动子（RIP2）序列并对其功能进行验证,为培育胰岛特异性表达外源基因的转基因动物奠定基础。【方法】根据GenBank中已发表的RIP2序列（J00748．1）设计引物,以大鼠基因组DNA为模板,PCR扩增RIP2序列,连接pMD18-T载体后用HindⅢ和BamH I进行双酶切,回收RIP2片段并连接至不含启动子的pEGFP-1载体上构建真核表达载体pEGFP-1-RIP2。重组质粒转染PK15细胞,24h后观察细胞荧光蛋白表达情况。【结果】克隆获得的RIP2序列与参考序列（J00748．1）的同源性为99．9％,存在3处碱基差异,即从起始密码子ATG（＋1）上游-57处有一个G碱基缺失,-387处C突变为A,-707处插入一个G碱基。RIP2序列存在一个TATA-box（-206～201位点）和一个CAAT-box（-343-339位点）。以重组质粒pEGFP-1-PIP2转染PK15细胞,24h后能观察到绿色荧光。【结论】克隆获得的大鼠RIP2序列具有启动子功能,但活性较CMV启动子弱。     

基于16S rRNA测序揭示杜洛克猪早期体重与肠道微生物的关系

本研究旨在探讨肠道微生物与杜洛克猪早期体重的关系。从91头80日龄杜洛克公猪中根据个体体重排序选择体重较轻(lighter body weight,LBW)的9头猪和体重较重(heavier body weight,HBW)的9头猪。通过对16S rRNA基因V3-V4区测序,分析了HBW和LBW组猪粪便中微生物多样性、组成和预测功能。结果显示,HBW和LBW组之间微生物的Alpha多样性无显著差异(P>0.05)。杜洛克仔猪肠道微生物的核心菌门为厚壁菌门(HBW和LBW组分别为65.62%和66.57%)和拟杆菌门(HBW和LBW组分别为30.87%和29.80%),核心菌属为普雷沃菌属(HBW和LBW组分别为23.82%和20.84%)、乳杆菌属(HBW和LBW组分别为9.11%和16.55%)、未分类的瘤胃菌科(HBW和LBW组分别为10.32%和9.98%)和未分类的毛螺菌科(HBW和LBW组分别为6.33%和4.53%)。PCoA分析显示,肠道微生物在杜洛克仔猪个体之间差异较小,但两组间在微生物组成上存在一些显著差异的菌属。在属水平上,HBW组猪中北里孢菌属、g_norank_o_Tremblayales、未命名的丹毒丝菌属、未分类的普雷沃氏菌科和粪芽孢菌属的丰度显著高于LBW组(P<0.05),棒状杆菌属在LBW组中的丰度显著高于HBW组(P<0.05)。此外,KEGG通路差异分析发现,倍半萜类化合物生物合成、胰岛素信号通路、抗坏血酸和醛酸代谢及安沙霉素类合成的途径显著富集于HBW组(P<0.05),分泌系统途径显著富集于LBW组(P<0.05)。本研究结果有助于理解猪早期肠道微生物与宿主间的相互作用和猪的健康养殖。     

猪不同生长阶段肠道微生物组的变化及其影响因素

肠道是机体重要的消化与免疫器官,维持肠道健康对猪的生长发育和疾病预防具有十分重要的意义。高通量测序技术的发展极大地促进了人们对肠道微生物功能的认知,猪肠道微生物组的研究正逐步成为热点。目前,尽管对某一生长阶段猪的肠道微生物组已有较为深入的理解,但仍缺乏有关商品猪整个生命周期范围内肠道微生物组动态变化的全面纵向研究。而从出生到出栏,猪在整个生长周期内的肠道微生物组并不是一成不变的,是一个动态的发育过程。作者综述了猪哺乳期、断奶期、育肥期和妊娠期等从出生到育肥过程中不同阶段肠道微生物组的纵向变化及其主要影响因素：一方面,肠道微生物群落结构的显著变化主要发生在断奶期;另一方面,虽然肠道微生物组成随着时间始终在不断变化,但仍有一部分优势菌是一直存在的,这部分优势菌被称为核心菌群,而只在特定时期才出现的菌只是胃肠道中的"过客",也最易受外界因素影响。肠道微生物组与多种因素相关,如年龄、饮食、环境、抗生素使用等,其中饮食对塑造肠道微生物起到至关重要的作用。本文可为理解猪在不同生长发育阶段肠道微生物的动态变化规律及改善猪生长性能和健康水平的微生物技术手段提供理论参考。     

广西巴马小型猪BMP2基因克隆、生物信息学及组织表达分析

本研究旨在对广西巴马小型猪骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic proteins 2,BMP2）基因进行克隆及其结构和功能的预测,并检测其在广西巴马小型猪和长白猪中的表达差异。以广西巴马小型猪基因组DNA为模板,通过测序鉴定BMP2基因外显子区的单核苷酸多态性（SNPs）,利用多种生物信息学软件对广西巴马小型猪BMP2基因启动子区、编码区（CDS）、3'UTR区进行了分析,预测分析广西巴马小型猪BMP2基因编码蛋白的基本理化性质、磷酸化位点、O-糖基化位点、跨膜区域、亲疏水性、蛋白质修饰结构、二级结构和三级结构等,并对miRNA结合位点及其相关通路进行分析,绘制了广西巴马小型猪和长白猪的组织表达谱。结果显示,试验成功克隆了广西巴马小型猪BMP2基因CDS区,总共1 188 bp,编码395个氨基酸;与猪参考基因组相比,广西巴马小型猪BMP2基因在G1663A、G1897C发生了同义突变,在C1896T（Pro→Leu）、T1971C（Gly→Ser）、G2000A（Leu→Ser）发生了3处错义突变;在3'UTR区域存在miR-142-5p、miR-129-5p等共13个miRNA结合区域;相似性比对结果显示,广西巴马小型猪与野猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊、马、澳洲野犬、家犬、猕猴对应区段的相似性依次为99.92%、91.75%、91.84%、91.92%、91.92%、90.50%、89.43%、90.91%和90.91%;系统进化树结果表明,广西巴马小型猪与野猪的亲缘关系最近,与黄牛的亲缘关系相对较近,与猕猴亲缘关系较远;BMP2蛋白分子质量为44.55 ku,理论等电点为8.37,预测其有12个O-糖基化位点,42个磷酸化位点;预测分析发现该蛋白为亲水性蛋白,且是膜外蛋白。组织表达谱发现,广西巴马小型猪生长板软骨中BMP2基因表达量显著低于长白猪（P<0.05）。该研究为进一步探索广西巴马小型猪中BMP2基因的功能提供了理论基础,也为广西巴马小型猪品种资源的利用提供了重要参考。     

广西巴马小型猪脂联素受体1和受体2 cDNA的克隆及序列分析

该试验根据GenBank中普通猪脂联素受体（AdipoR）mRNA序列,利用RT—PCR法对广西巴马小型猪AdipoR基因进行克隆,与NCBI中发表的猪AdipoR序列进行同源性比较,分析广西巴马小型猪AdipoR的cDNA及氨基酸序列结构特点,为进一步从分子水平上对广西巴马小型猪的生长发育提供理论依据,也为日后构建真核表达载体,研究AdipoR基因的生物功能奠定基础。     

陆川猪脂蛋白脂酶基因的克隆与序列分析

[目的]对陆川猪脂蛋白脂酶(LPL)基因进行克隆与序列分析,为后期开展LPL基因表达与陆川猪肌内脂肪沉积的相关性研究奠定基础.[方法]根据GenBank中已公布的猪LPL基因序列设计引物,以陆川猪背最长肌组织总RNA为模板,利用RT-PCR扩增其LPL基因,测序结果用Lasergene 7.0软件进行序列分析,用MEGA 6.0软件进行同源性比较及构建系统进化树,同时利用在线蛋白质结构分析软件(PMP)预测陆川猪LPL蛋白二级结构.[结果]成功克隆获得陆川猪LPL基因编码区长1437 bp,与GenBank中已公布普通猪、大白猪、杜洛克猪、通城猪、贵州白香猪的基因同源性分别为99.6%、99.7%、99.7%、99.7%和99.4%.陆川猪LPL基因第760位点存在特有的碱基A,该突变导致缬氨酸突变为蛋氨酸.由基于LPL基因碱基同源性构建的物种系统进化树可知,广西陆川猪与大白猪的遗传距离最近,其次是山羊,最远的是小鼠.蛋白二级结构预测结果表明,陆川猪的LPL蛋白二级结构包含有N-端结构域和C-端结构域两个区域,且存在PLAT/LH2.[结论]LPL基因可作为研究陆川猪脂肪沉积的主要候选基因之一.     

大白猪血清免疫指标的检测及相关性分析

血清免疫指标是衡量动物健康水平的重要指标。本研究采取南宁某大型核心种猪场标准饲养模式下的育肥期(80日龄)大白猪血清样品,其中公猪105头,母猪119头。检测肿瘤坏死因子α(TN Fα)、白细胞介素-6 (IL-6)、C-反应蛋白(CRP)的免疫水平,通过各指标的相关性分析及正态分布检验得出3项免疫指标的相关性及群体分布情况,为猪育肥期免疫指标的正常范围值和健康状况检测提供理论参考。结果表明,80日龄大白猪的TNFα、IL-6、CRP等3项指标间具有极显著相关性(P<0.01),各指标间相关系数均在0.4以上;性别因素对该时期指标表型的影响不显著。     

在冷冻过程中公牛精(子)细胞中蛋白质的渗出

<正> 目前国內评定冷冻精液质量主要的常规指标是指活力、密度、畸型率及顶体完整率,方法多是由观察者目测精子的运动和超微结构;但是根据精子的生化特性,在处理过程中有些生理上的变化当月侧观察还没有发现就已开始,或者是已发现了结构上的变化如     

猪体脂分解代谢在调节体脂沉积过程中作用的研究

长白和长二(长白×二花睑)猪各6头,在不同体重时,活体采取皮下脂肪组织,测定激素敏感脂酶(HSL)的活性;及体重30和90千克时,于进食后1.5小时和停时后15小时采血测定血液游离脂肪酸(FFA)的浓度。结果发现,体重75和90千克时,背部脂肪组织的HSL活性,长白猪显著高于长二猪(P<0.01);HSL活性有随体重增大而下降的趋势;血液中FFA浓度亦有随体重增大而下降的趋势,但只有长白猪的下降显著(P<0.05),停食15小时,长白猪血液中FFA浓度显著升高(P<0.05),长二猪的升高则很少(P>0.1)。