广西巴马小型猪MyoD1基因克隆及其真核表达载体的构建

本研究旨在对广西巴马小型猪成肌细胞决定基因1(myoblast-determining 1,MyoD1)进行克隆分析,并构建MyoD1基因真核表达载体pEGFP-N1-MyoD1,为进一步研究该基因在广西巴马小型猪骨骼肌发育中的调控作用奠定基础。以广西巴马小型猪的肝脏组织为材料,应用RT-PCR技术克隆得到广西巴马小型猪MyoD1基因编码序列,对其核苷酸序列和蛋白质序列进行生物信息学分析,并构建该基因的真核表达载体,经过PCR和双酶切验证,通过脂质体转染,将重组质粒转染C2C12细胞,在细胞水平验证了该载体的正确性。结果显示,广西巴马小型猪MyoD1基因编码区序列长960 bp,编码319个氨基酸,核苷酸序列与猪、牛、水牛、绵羊、马、人、小家鼠、褐家鼠、家犬的同源性依次为99.7%、92.8%、92.9%、92.6%、91.5%、82.9%、82.9%、82.0%和90.9%;系统进化树分析表明,广西巴马小型猪MyoD1基因在不同物种及进化过程中具有高度保守性;蛋白质结构分析表明,MyoD1蛋白为膜外蛋白,在第4-116位氨基酸处存在1个MyoD家族标志性的MyoD结构域,对广西巴马小型猪、猪和人的MyoD1蛋白高级结构比较发现其具有极高的相似性。本研究构建的广西巴马小型猪MyoD1基因表达载体pEGFP-N1-MyoD1,转染C2C12细胞后产生绿色荧光信号,表明MyoD1基因在C2C12细胞中成功表达。     

广西巴马小型猪SP1基因克隆测序及其真核表达载体的构建

[目的]克隆广西巴马小型猪特异性蛋白1(SP1)基因,并构建其真核表达载体,为揭示其对猪生长发育的调控机理打下基础.[方法]利用RT-PCR从广西巴马小型猪背最长肌组织中扩增SP1基因,采用DNASTAR、TMHMM等分别进行基因生物信息学分析;以pEGFP-N1质粒构建真核表达载体pEGFP-N1-SP1并转染293T细胞,于转染48 h后在倒置荧光显微镜下观察并拍照.[结果]克隆获得的广西巴马小型猪SP1基因与GenBank中野猪(Sus scrofa)的参考序列(XM_005652569.3)一致,未发现碱基突变位点;其编码序列(CDS)全长2340 bp,编码779个氨基酸.广西巴马小型猪SP1蛋白不存在跨膜结构,也不存在信号肽,不属于分泌型蛋白;其二级结构中α-螺旋占17.84%,延伸链占21.31%,β-转角占9.76%,无规则卷曲占51.09%.构建的真核表达载体pEGFP-N1-SP1能成功转染至293T细胞中并表达出绿色荧光蛋白.[结论]广西巴马小型猪SP1基因CDS序列编码蛋白主要参与细胞内活动,而非外分泌型蛋白,以SP1基因构建的真核表达载体pEGFP-N1-SP1能转染293T细胞并成功表达,可直接用于后期SP1基因功能探索及干扰表达等研究.     

广西巴马小型猪动脉粥样硬化模型的制作

本试验旨在制作广西巴马小型猪动脉粥样硬化模型,初步判断猪发生动脉粥样硬化时的指数值,以期为今后建立相关模型提供依据。试验选取广西巴马小型猪试验组和对照组各10头,通过饲喂高脂高胆固醇饲料建立动脉粥样硬化模型,检测建模过程中血液生化指标,将动脉粥样硬化指数与血管切片作关联分析,初步拟定发生动脉粥样硬化时的指数值。屠宰后血管切片结果显示,试验组有2头广西巴马小型猪发生动脉粥样硬化,对照组均正常。2头广西巴马小型猪的血管切片结果与动脉粥样硬化指数进行关联分析后,初步拟定的动脉粥样硬化指数值在3.8以上,并持续3个月以上。     

广西陆川猪和巴马香猪的分子生物学研究进展

陆川猪和巴马香猪均为产于广西被列入国家级地方品种遗传资源名录的具有优良性能的品种。近年来,深入开展地方品种猪的分子生物学基础研究已成为重点。作者现对广西陆川猪的遗传与繁殖、猪支原体肺炎病原分子致病机制,以及巴马香猪的遗传与繁殖、疾病模型方面的分子生物学研究作一综述。     

广西巴马小型猪LAIR-1基因cDNA克隆及序列分析

[目的]了解广西巴马小型猪白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR-1)基因的序列特征及基本结构,为以广西巴马小型猪作为人类器官模型及器官移植手术后的排斥反应研究奠定基础.[方法]根据GenBank上已登录的人和家鼠LAIR-1基因序列的保守区域,用Oligo设计合成1对引物,并以广西巴马小型猪总RNA为模板,对LAIR-1基因进行RT-PCR扩增,经PCR和双酶切鉴定后,进行测序及同源性比对分析.[结果]从广西巴马小型猪的外周血淋巴细胞中克隆获得LAIR-1基因cDNA序列,全长867 bp;与人、家鼠和挪威鼠的同源性分别为79.3%、50.9%和49.9%.[结论]广西巴马小型猪LAIR-1基因cDNA序列与人类的亲缘关系最近,进一步验证了广西巴马小型猪作为人类器官模型研究的可行性.     

利用中芯一号SNP芯片检测隆林猪全基因组拷贝数变异

【目的】检测隆林猪的全基因组拷贝数变异。【方法】采集33头隆林猪的耳组织样本,通过酚-氯仿法提取DNA后,使用猪中芯一号50K SNP芯片进行基因分型,得到的原始数据通过Genomestudio软件和Linux系统进行处理,使用CNVPartition和PennCNV软件分别检测拷贝数变异(copy number variation, CNV),并利用Bedtools软件将CNV合并为拷贝数变异区域(copy number variation region, CNVR),使用Biomart对CNVR进行基因定位,利用David网站对定位到的基因进行GO和KEGG富集分析,使用猪QTL数据库对共同CNVR进行QTL注释。【结果】CNVPartition软件共检测到260个CNVs,合并为47个CNVRs,其中缺失型40个、获得型5个、混合型2个,共定位到84个基因,显著富集到13条信号通路;PennCNV软件共检测到96个CNVs,合并为15个CNVRs,其中缺失型9个、获得型1个、混合型5个,共定位到8个基因,显著富集到8条信号通路;2个软件检测结果定位到的基因主要富集在嗅觉相关通路和...     

猪肾细胞(PK15细胞)ABCA1基因与miRNA-758关系的研究

为了研究猪肾细胞(PK15细胞)中三磷酸腺苷结合盒转运蛋白A1(ABCA1)mRNA与miRNA-758表达量之间的关系,试验利用miR-758模拟物、miR-758抑制物及其各自的阴性对照分别转染PK15细胞,利用Real-time qPCR技术检测转染24 h后细胞内ABCA1 mRNA与miR-758相对表达量并讨论其之间的关系。结果表明:在PK15细胞中转染miR-758模拟物、miR-758抑制物及其各自的阴性对照后,ABCA1 mRNA表达量均极显著升高(P0.01)。转染miR-758模拟物的PK15细胞miRNA-758表达量高于对照组30 000多倍,差异极显著(P0.01);而其他转染组miR-758表达量均低于对照组,但差异不显著(P0.05)。说明miR-758模拟物、miR-758抑制物及其各自的阴性对照均可导致PK15细胞内ABCA1 mRNA表达量升高;miR-758模拟物可促进PK15细胞miR-758表达量上升30 000多倍,而对ABCA1 mRNA表达量并未表现出抑制作用,PK15细胞中ABCA1mRNA的表达量不受miR-758模拟物影响或受影响小;miR-758抑制物确实能够抑制miR-758表达量,并使ABCA1 mRNA表达量升高。     

几个中国地方猪群体遗传结构和产仔数性状选择信号分析

旨在对几个中国地方猪品种进行群体遗传结构分析,并筛选与中国地方猪产仔数相关的基因组选择信号及候选基因.本研究下载了6个中国地方品种猪共计102头个体的Illumina PorcineSNP60芯片数据,构建了包括19头迪庆藏猪、16头明光小耳猪、16头五指山猪在内的低产仔数组和包括11头姜曲海猪、20头蓝塘猪、20头梅...     

广西眼镜蛇神经毒素的原核表达

利用拼接PCR法从广西眼镜蛇基因组DNA中获得CT成熟肽序列,序列分析显示,广西眼镜蛇与其他地区眼镜蛇的CT基因成熟肽序列具有较高的同源性,同时成功构建了pET30 a(+)-CT原核表达载体;研究结果表明,利用拼接PCR的方法能有效拼接两个外显子序列,广西眼镜蛇CT基因具有较高的保守性,CT基因可在大肠杆菌中表达。     

广西巴马小型猪ApoE基因真核表达载体的构建及鉴定

【目的】构建广西巴马小型猪载脂蛋白E基因（ApoE）真核表达载体,为生产转ApoE基因的广西巴马小型猪奠定基础。【方法】采用RT-PCR从广西巴马小型猪肝组织中扩增出ApoE基因编码序列,将该基因连接至pEGFP-C1载体上,利用双酶切和测序对重组质粒pEGFP-C1-ApoE进行鉴定,并将重组质粒pEGFP-C1-ApoE转染PK15细胞。【结果】广西巴马小型猪ApoE基因编码区序列长954 bp,编码317个氨基酸,与GenBank已公布的猪ApoE基因cDNA序列（NM_214308）对应区段同源性为100%。构建的重组质粒pEGFP-C1-ApoE转染PK15细胞48 h后,在荧光显微镜下转染细胞发出荧光,细胞形态清晰,可见细胞核。【结论】广西巴马小型猪ApoE基因能与pEGFP-C1载体重组构建pEGFP-C1-ApoE真核表达载体,有效表达出ApoE蛋白。