新型鸭呼肠孤病毒、新型鹅细小病毒和鸭坦布苏病毒多重PCR检测方法的建立及初步应用

[目的]建立能同时检测新型鸭呼肠孤病毒(New-type duck reovirus,NDRV)、新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus,NGPV)和鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)的方法.[方法]根据NDRV、NGPV和DTMUV基因组的保守区域设计3对特异性引物...     

蛙嗜水气单胞菌的分离鉴定

从丰城某养殖场发病蛙苗中分离出两株细菌 ,经人工感染试验 ,对健康鲫鱼、小白鼠产生同蛙苗相一致的病症。经细菌形态特征、培养特性及生理生化特性等试验 ,鉴定为嗜水气单胞菌 (Aeromonashydrophila ,AH)。药敏试验表明 ,两株细菌对痢特灵、多粘菌素、阿米卡星、头孢唑啉敏感     

番鸭O_(13)大肠杆菌和2型鸭疫里默氏菌混合感染的诊断

致病性大肠埃希氏菌(Escherichia coli)和鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer)是养鸭生产中最为常见的2种致病性细菌，它们在临床上多以原发或继发于其它疾病出现．有时则表现为二者的混合感染，对养鸭业的危害较大。对于禽类，致病性大肠埃希氏菌的血清型众多，鸭疫里默氏菌也存在多种血清型，二者的血清型之间存在交叉保护，     

2010-2011年中国部分地区禽坦布苏病毒感染调查及分子变异分析

为了解中国目前禽坦布苏病毒在家禽中的流行状况及病毒分子演化特征,对2010-2011年采集自中国沿海及周边的9个省的439份疑似家禽坦布苏病毒感染的临床样品进行了鉴定,并进行了分离毒株NS5基因的分子遗传进化分析。结果表明,2010年采集的187份家禽病料中检测出42份阳性样品,阳性率为21．6％,而2011年采集的252份样品中检测出37份阳性样品,阳性率为13．9％。对部分毒株的NS5基因测序表明,本研究分离的禽坦布苏病毒与已发布的同时期分离的禽坦布苏病毒NS5基因同源性在98％以上,与2010年前分离的鸡源及蚊媒坦布苏病毒的同源性介于83．8％-85．8％之间;所有2010年后分离的禽坦布苏病毒毒株在系统进化上共同构成了一个进化分支。结果表明,2011年禽坦布苏病毒仍在中国沿海及周边的9个省的家禽中流行,病毒NS5基因的测序分析表明,到目前为止在家禽中流行的禽坦布苏病毒未出现明显的分子变异。     

噬菌体RAP44感染鸭疫里默氏菌的电镜观察

为了解噬菌体RAP44对鸭疫里默氏菌的侵染及裂解过程,本研究应用透射电镜进行观察。结果显示,噬菌体RAP44头部外廓呈六边形,平均直径约60nm,尾长约210nm,尾宽约8nm。RAP44与宿主菌混合后,5min内即能通过尾丝吸附于鸭疫里默氏菌的中部,开始感染过程;40min后细菌裂解,释放子代噬菌体。本研究为噬菌体作为抗生素替代品治疗鸭疫里默氏菌感染的研究提供了形态学依据。     

鸡黄病毒灭活疫苗的研制及免疫效果研究

鸡黄病毒FQ—C1株经SPF鸡胚连续传40代后,检测其尿囊液毒的ELD50达到1×10^-4.33／0．1mL。将该病毒第40代SPF鸡胚液毒灭活后制备成油乳剂灭活疫苗。SPF雏鸡和蛋鸡安全性试验表明,该疫苗的安全性好,无不良影响。以该疫苗一次单剂量（1mI／只）免疫开产蛋鸡,28d后攻以鸡黄病毒强毒测定疫苗的保护效果,结果显示疫苗免疫组较未免疫组蛋鸡的产蛋率高出75．8％,产蛋保护率达93．2％以上。试验表明,本研究制备的鸡黄病毒灭活疫苗安全性好,且具有良好的免疫原性,免疫后可有效抵抗鸡黄病毒所致的产蛋骤降。     

禽坦布苏病毒E基因与沙门菌鞭毛保守区的嵌合表达研究

利用PCR方法从禽坦布苏病毒和肠炎沙门菌分别扩增出E基因和鞭毛基因保守片段(Flic AC和Flic DB),随后通过over-lapping PCR方法将Flic AC片段、E基因和Flic DB片段依序串联后获得Flic AC-E-Flic DB目的片段,克隆到p MD18-T载体中获得重组质粒p MD-Flic AC-E-Flic DB,经Bam HⅠ和HindⅢ双酶切后接入p ET-32a载体,构建原核表达重组质粒p ET-Flic AC-E-Flic DB。表达质粒转化入感受态细胞BL21(DE3)后,经IPTG诱导后表达出Flic AC-E-Flic DB嵌合蛋白,Western-blot鉴定证实与预期融合蛋白一致。     

禽源多杀性巴氏杆菌耐药性分析及氟苯尼考耐药基因floR分布

为了解禽源多杀性巴氏杆菌的药物敏感性及氟苯尼考的耐药基因的分布特征,采用琼脂二倍稀释法,对分离自福建、广东和江西等南方数省部分地区113株禽源多杀性巴氏杆菌进行9种抗生素的耐药性分析,并应用PCR方法检测氟苯尼考耐药基因floR的分布情况。结果显示:上述菌株对四环素表现高水平耐药,耐药率为65.49%(74/113);对链霉素、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑、氟苯尼考、卡那霉素与恩诺沙星表现中等水平耐药,耐药率分别是43.36%(49/113)、39.82%(45/113)、27.43%(31/113)、25.66%(29/113)与24.78%(28/113);对氨苄西林、头孢噻呋与头孢克洛较为敏感,耐药率分别为4.42%(5/113),2.65%(3/113)与1.77%(2/113);其中52.21%(59/113)菌株能耐受3类及3类以上的抗菌药物;氟苯尼考耐药基因floR的检出率为64.04%(72/113),且所有氟苯尼考耐药菌株均含有floR基因。结论:113株禽源多杀性巴氏杆菌存在多重耐药现象,且floR耐药基因较为流行。本研究结果为上述地区针对禽源多杀性巴氏杆菌临床用药提供科学依据。     

鸭三种病毒性疾病多重PCR检测方法的建立及初步应用

为了一次性检测临床样品中是否存在鸭新城疫病毒(NDV)、鸭瘟病毒(DPV)或鸭坦布苏病毒(DTMUV)感染,本研究根据GenBank已登录的3种病原的保守基因序列,分别设计了3对特异性引物,通过优化扩增条件,建立了可同时检测NDV、DPV和DTMUV的多重PCR检测方法。特异性检验表明,该多重PCR方法可同时扩增出NDV(510bp)、DPV(400bp)、DTMUV(300bp)的特异片段,对其他鸭常感染病毒扩增结果均为阴性;敏感性测定表明,该多重PCR技术最低能检出1.02×10~4拷贝·μL~(-1) NDV、3.50×10~3拷贝·μL~(-1) DPV和1.17×10~4拷贝·μL~(-1) DTMUV。采用建立的多重PCR方法对250份临床样品进行检测结果显示,其检测结果与该3种病毒的常规单一PCR检测结果符合率为100%。以上结果表明,本研究建立的多重PCR检测方法具有快速、特异性强、敏感性高等优点,适用于临床样品中上述3种病原的检测。     

鸭疫里默氏菌噬菌体裂解酶的原核表达

为了原核表达鸭疫里默氏菌噬菌体RAP44的裂解酶基因,以噬菌体RAP44的基因组为模板,用PCR方法扩增裂解酶基因,与表达载体p GEX-6P-1连接,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中表达,利用谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和柱纯化表达蛋白。结果成功构建了表达载体p GEX-N,转化菌经IPTG诱导后成功表达出了分子量约为37 k D的可溶性重组蛋白。本研究获得了纯化的鸭疫里默氏菌噬菌体裂解酶重组蛋白,为裂解酶的功能研究奠定了基础。