中药王不留行增乳活性单体及催乳素对奶牛乳腺上皮细胞特异性miRNA的影响

本试验旨在研究中药王不留行增乳活性单体邻苯二甲酸二丁酯及催乳素对奶牛泌乳中期乳腺上皮细胞miRNAs表达的影响;荧光定量RT-PCR检测增乳活性单体邻苯二甲酸二丁酯及催乳素作用后乳腺上皮细胞miRNAs表达变化;王不留行增乳活性单体邻苯二甲酸二丁酯及催乳素均抑制原代培养的泌乳中期奶牛乳腺上皮细胞miRNA-143、miRNA-125和miRNA-195表达;邻苯二甲酸二丁酯可抑制miRNA-21表达,催乳素对miRNA-21表达的影响尚不确定。首次阐明中药王不留行增乳活性单体邻苯二甲酸二丁酯和催乳素能引起乳腺上皮细胞miRNAs表达变化。     

奶牛乳腺发育与泌乳过程中能量代谢的变化

为确定奶牛乳腺发育与泌乳各时期能量代谢状况及建立生物调控技术,应用试剂盒及高效液相色谱法(HPLC),对奶牛乳腺发育与泌乳过程中能量代谢重要指标进行了测定。结果表明,己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、甘油三酯、葡萄糖、乳糖、β-酪蛋白、ATP酶、能荷值和NADPH等指标在不同时期都存在差异,即青春期14个月时的葡萄糖浓度最高,妊娠4个月时的NADPH含量最高,围产前期时的甘油三酯含量、乳糖含量和能荷值最高,泌乳7 d时异柠檬酸脱氢酶活性和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性最高,泌乳140 d时的Ca2+Mg2+-ATP酶的活性最高,泌乳280 d时的Na+K+-ATP酶活性最高,退化期3 d的β-酪蛋白含量最高,退化期30 d时的己糖激酶活性最高。揭示了奶牛乳腺发育与泌乳过程中能量代谢的变化规律。     

奶山羊乳腺上皮细胞系的建立

乳腺上皮细胞系的建立为乳蛋白基因表达调控机制的研究及乳腺表达载体的检测提供有利条件。本研究建立了正常培养的奶山羊乳腺上皮细胞系。利用胶原酶和透明质酸消化法从奶山羊乳腺组织中分离并获得了纯化的乳腺上皮细胞,利用细胞角蛋白18的免疫荧光染色对乳腺上皮细胞进行了鉴定。通过细胞生长曲线、群体倍增时间、细胞接种存活率、细胞活力检测等生物学性状的检测建立并鉴定了奶山羊乳腺上皮细胞系。结果表明,奶山羊乳腺上皮细胞在添加表皮生长因子、胰岛素样生长因子-1、转铁蛋白-硒钠、10%胎牛血清的DF12培养液中生长状态良好,细胞传至30代时仍保持旺盛的增殖活力。通过细胞传代及反复冻存和复苏实现了细胞系的长期保存,建立了乳腺上皮细胞系,获得了大量的乳腺上皮细胞。从而为开展奶山羊、奶牛等产奶动物乳腺生物反应器及泌乳机制的研究提供了便利条件。     

乳脂合成前体对奶牛乳腺上皮细胞亚细胞蛋白质组学影响

向奶牛乳腺上皮细胞中添加β-羟基丁酸钠,利用双向电泳技术进行细胞亚细胞蛋白质组学方面的研究。结果表明,β-羟基丁酸钠对奶牛乳腺上皮细胞亚细胞蛋白表达有显著影响。Imagemaster6.0软件分析出4个表达上调的蛋白点,鉴定分别是ENO1、α-glucosidase、plastin3和ARPC2。通过实时荧光PCR检测以上蛋白在mRNA水平的表达差异,结果均有不同程度的提高,其中以ENO1、α-glucosidase及Arpc2提高显著(P<0.05)。研究所筛选出的蛋白,将有助于进一步揭示奶牛乳腺上皮细胞增殖和泌乳机制。     

共轭亚油酸对奶牛乳腺上皮细胞脂肪酸摄取与转运相关基因mRNA转录的影响

为了研究共轭亚油酸(CLA)对奶牛乳腺上皮细胞脂肪酸摄取与转运相关基因mRNA转录的影响,试验采用组织块法体外培养奶牛乳腺上皮细胞,外源添加不同浓度的c9,t11-CLA与t10,c12-CLA作用乳腺上皮细胞48 h,应用实时荧光定量PCR技术,测定相关基因mRNA的转录。结果表明:1)与对照组相比,两种CLA均显著降低了脂蛋白脂肪酶(LPL)基因mRNA的表达丰度(P<0.05);2)150μmol/L c9,t11-CLA显著上调分化抗原簇36(CD36)基因mRNA的转录水平(P<0.05),其转录水平随t10,c12-CLA浓度增加显著上升(P<0.05);3)150μmol/L c9,t11-CLA和不同浓度的t10,c12-CLA均可显著上调乙酰辅酶A结合蛋白(ACBP)的转录(P<0.05);4)与对照组相比,两种CLA均显著下调脂肪酸结合蛋白3(FABP3)基因mRNA的转录水平(P<0.05)。说明两种CLA均显著下调LPL mRNA和FABP3 mRNA的转录水平,150μmol/L的两种CLA异构体上调CD36和ACBP的转录水平。