转运蛋白MoMfs2对稻瘟病菌细胞壁完整性和杀菌剂外排的调控

【目的】稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病是水稻生产上一种最具破坏性的真菌病害,严重威胁我国的水稻生产安全。研究转运蛋白MoMfs2编码基因MoMFS2(MGG＿01301)在稻瘟病菌生长发育及致病过程中的功能,为开发新型杀菌剂提供参考。【方法】利用基因敲除策略将其进行缺失突变并对突变体进行了一系列的生物学表型分析。【结果】实验显示该突变体无论在自然培养基还是在合成培养基上,生长速率较野生型均没有变化,表明MoMFS2基因不参与稻瘟病菌对营养的吸收利用;另外,该突变体原生质体释放速度变慢,对细胞壁胁迫因子刚果红和SDS耐受性显著增强,表明该基因参与了对细胞壁胁迫的应答,进一步推测其在稻瘟病菌细胞壁完整性发挥重要作用。此外,该突变体不能在含有刚果红和ABTS平板上产生晕圈,同时其对胞外漆酶和过氧化物酶的分泌显著降低,表明MoMfs2参与了对胞外漆酶和过氧化物酶的分泌;另外该突变体对不同类型的杀菌剂(咪鲜胺、多菌灵、和嘧菌酯)敏感性显著增强,表明该突变体对杀菌剂的耐受性降低,推测MoMFS2基因参与了稻瘟病菌对杀菌剂的外排。通过水稻喷雾和大麦离体致病性测定发现该突...     

禾谷镰孢菌微管相关蛋白基因(map)克隆及其与多菌灵抗药性关系分析

根据禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum) 测序菌株NRRL31084(PH-1) 的微管相关蛋白基因(map) 核苷酸序列设计4对引物,采用PCR方法测定了禾谷镰孢菌埘多菌灵(MBC) 不同敏感性表型的6个中国菌株的map全序列.DNA序列比对表明,中国的3个敏感菌株和3个抗药菌株的map核苷酸序列相似性没有差异,表明多菌灵抗药性与微管相关蛋白无关.该基因全长1 793 bp,含有6个内含子,编码199个氨基酸;与NRRL31084的map核苷酸序列相似性为99.39%,存在10个差异核甘酸,与其所编码的氨幕酸序列相似性为100%.     

稻曲病菌突变体B-726生物学性状分析及其T-DNA插入位点侧翼序列的克隆

【目的】分析稻曲病菌T-DNA插入突变体库中致病力减弱突变菌株B-726的生物学性状,分析其T-DNA插入位点的侧翼序列,克隆因外源基因插入被破坏正常表达的基因,为明确该基因在稻曲病菌致病过程中的作用奠定基础,并为稻曲病防治新途径的制定提供理论依据。【方法】通过测定突变菌株B-726生长速率、产孢能力及致病力检测,分析其生物学性状;Southern杂交分析B-726外源基因插入的拷贝数;利用HiTail-PCR 获得T-DNA插入位点的侧翼序列;运用RACE-PCR技术,克隆与插入位点毗邻的基因全长;用半定量RT-PCR分析该基因表达情况。【结果】突变菌株B-726与野生菌株P1相比致病力极显著下降,产孢能力、生长速率显著下降。Southern杂交结果显示T-DNA在菌株B-726中以单拷贝形式插入。经过序列分析发现,T-DNA插入在1个命名为Uvt-726上游344 bp处,半定量PCR结果表明,Uvt-726在B-726表达量较P1显著下降。【结论】克隆了1个可能与稻曲病菌致病力相关的基因,推断该基因在稻曲病菌致病过程中起着重要的作用。     

稻曲病菌分生孢子高产突变体A2588的T-DNA 插入位点侧翼基因分析

【目的】克隆稻曲病菌（Ustilaginoidea virens）分生孢子高产突变菌株A2588的T-DNA插入突变基因,解析该基因在稻曲病菌分生孢子形成中的功能,为进一步揭示稻曲病菌的分生孢子形成机制提供理论基础。【方法】测定A2588的产分生孢子能力、孢子萌发率、菌丝直线生长能力和热敏感性等生物学特性,利用hiTAIL-PCR、RACE和半定量PCR等方法克隆T-DNA插入突变基因,并结合生物信息学方法分析T-DNA插入导致分生孢子产量提高的分子机理。【结果】与稻曲病菌野生型菌株70-22相比,突变菌株A2588在PS培养液中产生数量为10倍以上的分生孢子,在MM培养液中产生数量约20倍的分生孢子,其在PS培养液中培养的菌球较为致密;在PSA和MM固体培养基上A2588产孢周期较短,孢子萌发率较低,虽然菌丝生长速度无明显差异,但热处理后菌丝不能恢复正常生长速率。hiTAIL-PCR和RACE法克隆了A2588中T-DNA侧翼基因,并利用RT-PCR检测侧翼基因表达水平,结果表明T-DNA侧翼基因spo76表达水平下降,进一步分析发现T-DNA可能插入至spo76的启动子区域,从而破坏了该基因启动子的部分功能。【结论】稻曲病菌突变菌株A2588中,T-DNA插入导致spo76启动子功能部分缺失,spo76表达水平下降,可能使A2588产孢周期缩短,并产生更多分生孢子。     

硫色曲霉SQ-3固态发酵产酶条件的优化

研究了不同培养时间、培养温度、pH值、碳源以及氮源等5个条件对硫色曲霉SQ-3产木聚糖酶、淀粉酶和纤维素酶活性的影响,并检测了不同烘干温度对发酵料中3种酶的活性和孢子存活数的影响。结果表明,在培养温度为28 ℃,初始pH值为7.0,固体发酵料中玉米秸秆粉为25.7%,豆粕为5.8%,麦麸为8.5%,1%的NaNO₃溶液为60%且培养时间为3 d时,硫色曲霉SQ-3的3种酶活性均较高:纤维素酶活性为453.3 U·g^-1,淀粉酶活性达3.9×10³ U·g^-1,而木聚糖酶活性达1.48×10⁵ U·g^-1。在烘干温度为40 ℃时,发酵料中孢子存活数不低于1.1×10⁸ g^-1,木聚糖酶活性保留较好,纤维素酶和淀粉酶也保留大部分活性。结果表明,上述发酵条件适合于硫色曲霉SQ-3低成本且高效的产酶培养。     

莲子草假隔链格孢SF．193的细胞壁降解酶研究

采用3,5一二硝基水杨酸法分析了莲子草假隔链格孢NimbyaalternantheraeSF一193菌株在活体内外产生的羧甲基纤维素酶（Cx）、口．葡萄糖苷酶、木聚糖酶、聚甲基半乳糖醛酸酶（PMG）和多聚半乳糖醛酸酶（PG）的活性。结果表明,SF一193可产生cx、伊葡萄糖苷酶、木聚糖酶和PG,且4种细胞壁降解酶在活体外和活体内的活性显著不同。其发酵滤液中以PG活性最高,其次为木聚糖酶、,β-葡萄糖苷酶和Cx;在空心莲子草叶片内以Cx活性最高,其次为β一葡萄糖苷酶、木聚糖酶和PG。在活体内,4种酶活性随接种天数和温度的变化而不同。Cx和卢．葡萄糖苷酶的活性在接种第3d达到最大,木聚糖酶和PG活性则分别在第2d和第5d达到最大;Cx、卢一葡萄糖苷酶和PG活性在30℃时最高,而木聚糖酶活性在35℃时最高。     

解淀粉芽胞杆菌Jt84防治水稻稻曲病田间应用技术研究

为了明确解淀粉芽胞杆菌Jt84防治水稻稻曲病田间应用技术,本文初步研究生防菌Jt84定殖规律以及不同喷施时期对水稻稻曲病的防效.结果显示:生防菌Jt84在水稻叶表能够有效定殖,7～16 d时,叶表定殖菌量维持在104cfu/cm2,30 d仍可在水稻叶表检测到生防菌Jt84;生防菌Jt84防治水稻稻曲病的最佳防治时期为...     

枯草芽孢杆菌Bs-916草酸脱羧酶基因Bacisubin的克隆、原核表达及其表达产物的酶活性分析

为明确枯草芽孢杆菌生防菌株Bs-916的抑菌蛋白质Bacisubin的编码基因,并初步解析Bacisubin的抑菌机理,根据该蛋白质的部分序列设计简并引物,获得了编码基因的部分序列,参考基因组数据库克隆了Bacisubin基因全序列。将Bacisubin基因克隆至PET28a(+)中,在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中表达获得His标签融合蛋白质,并利用次甲基蓝-重铬酸钾法初步检测了该融合蛋白质的酶催化活性。克隆获得Bacisubin基因开放阅读框序列共1 161 bp,G+C含量为51.3%,可编码386个氨基酸,编码蛋白质与Bs-168菌株的草酸脱羧酶Yvrk蛋白质的氨基酸相似度为87%,与其他多种细菌和真菌的草酸脱羧酶的N端和C端Cupin活性中心区域和Mn2+结合区域高度保守。预测Bacisubin分子量为43 600,等电点为5.18,是较稳定的可溶性草酸脱羧酶,其催化最适pH为6.0左右,最适温度为30℃左右。说明枯草芽孢杆菌Bs-916的抑菌蛋白质Bacisubin为草酸脱羧酶,抑菌作用可能与其降解草酸的能力有关。     

桧状青霉原生质体制备和再生的研究

本文对桧状青霉H16的原生质体制备和再生的相关影响因子进行了初步的研究。结果表明：于30℃,转速为200 r/min的SDYS培养基中培养了16 h的菌丝,经S1溶液洗涤后,在1 mol/L的NaCl为等渗溶液,采用浓度为10 mg/mL的酶液,酶解温度为35℃,转速为100 r/min的条件下处理1.5 h时原生质体量达到最佳,本实验范围内最高达到6×106个/mL;同时,选取含有25 mmol/L Ca2＋的改良的察氏培养基培养经S2洗涤的原生质体时,原生质体可以达到较佳的再生率,本实验范围内最高达到24.3%。该研究为桧状青霉后期的菌株改造和遗传转化体系的建立奠定了基础。     

生防菌解淀粉芽胞杆菌Lx-11悬乳剂研制及其对水稻白叶枯病的防治效果评价

目前已经登记的芽胞杆菌微生物杀菌剂剂型以悬浮剂和可湿性粉剂为主,剂型相对比较单一,为进一步提高货架期和利用效率,以解淀粉芽胞杆菌Lx-11作为研究对象,筛选出纳米材料作为载体,添加各种不同功能性助剂,在高速均质机的作用下剪切、均质,研制出解淀粉芽胞杆菌Lx-11悬乳剂。解淀粉芽胞杆菌Lx-11悬乳剂配方：发酵液70%～80%,吸附载体白炭黑10%～15%,大豆油30%～50%,乳化剂Span80和Tween80复配6%～10%,分散剂脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸钠1%～3%,防冻剂乙二醇2%～4%,增效助剂SY-6535 1.5%～2.5%。该制剂的性能指标为：活菌体含量大于8×10⁸cfu/mL,悬浮率大于85%,粘度225 mPa·s,热贮稳定性合格;各项技术指标均符合产品标准要求。田间药效试验表明：解淀粉芽胞杆菌Lx-11悬乳剂对水稻白叶枯病的防治效果显著高于其发酵液。