1株E亚群禽白血病病毒的分离鉴定及遗传进化分析

E亚群禽白血病病毒（ALV-E）是指存在于鸡染色体中的内源性逆转录病毒基因组DNA或片段。具有转录活性的ALV-E既会对鸡的生产性能（体重和产蛋率）产生负面影响,又能从抗体水平干扰对外源性ALV的鉴别诊断。为对黑龙江省某鸡场内一禽白血病病毒RT-PCR阳性病料进行病毒分离鉴定及分析其基因组特征和遗传进化情况,通过分子生物学、病毒形态学及全基因组序列测定方法对病毒培养物进行鉴定和分析,结果显示,该分离株可在CEF细胞盲传至第9代,电镜下可观察到近似球形、直径约为80 nm,并具有囊膜和纤突结构的病毒粒子,将其命名为HLJE2020株。序列分析结果显示,其全基因组序列中的gag和pol基因相对保守,LTR和env基因与ALV-E同属一个进化分支,而gp85基因则与ALV-E和ALV-B均具有较高相似性,遗传进化分析显示在ALV-E和ALV-B间出现一个单独的分支,结合RDPv.4和SimPlot软件分析结果,推测该毒株gp85基因可能存在E亚群AF229株与B亚群SDAU09C1株的重组现象。本研究为了解禽白血病病毒基因组遗传演化情况提供数据资料,并为ALV的防控提供参考和依据。     

猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体的制备及其在检测组织中病毒的初步应用

旨在建立一种在感染初期对猪传染性胃肠炎(TGE)进行快速准确诊断的方法。本试验使用猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)经蔗糖梯度离心后用于免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体,经4次亚克隆及Western blot、间接免疫荧光(IFA)鉴定后筛选出1株能够稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株3G11。通过试剂盒将3G11单抗与辣根过氧化物酶(HRP)偶联,然后以HRP-3G11作为一抗,利用免疫酶组织化学法检测小肠组织病料中的TGEV。结果表明：HRP-3G11作为一抗经镜检可见特异性红棕色沉淀,即HRP-3G11单抗可以与小肠组织中病毒发生特异结合,试验过程耗时少且可视化显色结果优于未标记一抗使用酶标二抗组,证实了标记后单抗HRP-3G11可以作为直接检测抗体应用于免疫酶组织化学法中检测用小肠组织中的TGEV。     

传染性造血组织坏死病毒糖蛋白基因的原核表达及抗原性分析

应用RT-PCR方法扩增了传染性造血组织坏死病毒IHNV-ZYX株编码的糖蛋白(G)基因,将G基因克隆至原核表达载体pET30b,并在大肠杆菌Rosetta( DE3)中得到了表达.SDS-PAGE分析表明,重组菌诱导后得到了预期大小的G蛋白.提取G蛋白的包涵体,并制备抗血清.间接ELISA和Western-blott...     

表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌微胶囊制备工艺的优化

为使重组乳酸乳球菌在发酵生产后便于存储、运输,本试验利用可表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363制备微胶囊,优化微胶囊的制备工艺条件,并对胶囊化后重组菌的相关生物学特性进行检测。通过对不同壁材及壁材浓度进行控制单一变量试验,测定其包埋量,以筛选出最佳壁材及浓度。通过模拟胃肠液环境试验,比较微胶囊释放率,并对不同壁材进行保存期试验,比较最低活菌数,利用响应面试验确定最佳工艺条件,使用最佳工艺条件制备微胶囊后进行验证。优化后的结果为:选取海藻酸钠和壳聚糖作为壁材,在海藻酸钠浓度为2.49%,壳聚糖浓度为0.96%,CaCl₂浓度为6.67%,凝固时间为57 min的条件下微胶囊效果最佳,预测包埋量为7.85×10⁸ CFU/g。微胶囊在模拟胃液中稳定存在,在模拟肠液中可完全破裂,能释放出微胶囊内95%以上的乳酸乳球菌。海藻酸钠-壳聚糖微胶囊在4 ℃保存3周后,微胶囊中活菌数为1.41×10⁷ CFU/g。对微胶囊的最佳工艺条件验证结果为微胶囊的包埋量为8.08×10⁸ CFU/g;常温保存2周后,活菌数仍可达到3.89×10⁶ CFU/g;ELISA方法检测微胶囊内重组乳酸乳球菌可见表达的牛乳铁蛋白肽,抑菌试验可见微胶囊内重组乳酸乳球菌表达的牛乳铁蛋白肽对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌仍具有明显的抑制作用。以上结果表明,表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌可制备成为低成本、保存期长、耐胃液的微胶囊,为重组乳酸菌在生产中的进一步应用奠定基础。     

重组禽流感病毒(H5N2)的拯救及其生物学特性分析

为控制在我国流行的H5N1高致病性禽流感(Avian influenza virus,AIV)和筛选具有标记的疫苗毒株,用流行的H5N1亚型AIV的HA基因和H9N2亚型AIV的NA基因及H1N1亚型AIV(A/PR/8/34毒株)的6个内部基因通过流感8质粒反向遗传操作系统拯救了重组病毒rH5N2/PR8株。为了降低重组病毒的毒力,对H5N1亚型AIV的HA基因进行了修饰,使其裂解模式由PLRERRRKR↓GL修饰为PLIETR↓GL。将获得的rH5N2/PR8株在9日龄SPF鸡胚上连续传10代。该重组病毒的血凝效价稳定在1:2048,其半数感染量(EID50)可达10-8.77/0.1 mL。该病毒的毒力显著降低,对鸡胚的半数致死量(ELD50)为10-5/0.1 mL。将该病毒灭活与油佐剂乳化,制成灭活疫苗,给6周龄SFP鸡接种不同剂量,接种21 d后,用H5N1流行野毒A/Chicken/SD/2010(H5N1)攻击,结果显示:接种剂量为0.1 mL/只的试验组,10只鸡中有5只获得保护;接种0.3 mL/只的试验组可获得100%保护。以上说明,本实验获得的重组病毒具有疫苗标记、繁殖滴度高、毒力低、免疫原性好等特点,非常适合作为"标记疫苗"候选株,为AIV(H5N1)的标记疫苗研发奠定了坚实基础。     

猪流行性腹泻病毒重组酶聚合酶扩增快速诊断方法的建立和应用

旨在建立一种针对猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)的敏感性高、特异性强的快速临床诊断方法。以猪流行性腹泻病毒cDNA为模板,在重组酶和聚合酶的共同作用下实现对目的基因的扩增,本研究设计了用于重组酶聚合酶扩增的引物,优化了重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)反应体系,检测了反应的特异性和敏感性,确定了反应的最佳温度和时间,通过结合琼脂糖凝胶电泳和侧流层析试纸条的方法进行分析和鉴定。试验结果显示反应的最佳温度和时间为30℃、20 min,反应可以检测到的最低质粒拷贝数为10² copies·μL^-1,且在对猪的丁型冠状病毒、传染性胃肠炎病毒、轮状病毒和圆环病毒2型的检测中具有良好的特异性。综上所述,通过对RPA反应条件的摸索与优化,成功建立了猪流行性腹泻病毒重组酶聚合酶扩增结合琼脂糖凝胶电泳(Basic RPA)和侧流层析试纸条(LF-RPA)的检测方法,两种方法相比较于RT-PCR,有更短的检测时间且具有更高的敏感性,对...     

表达乳铁蛋白肽的猪源罗伊氏乳酸杆菌对断乳仔猪抗霍乱沙门菌感染的效果分析

旨在分析表达牛乳铁蛋白肽的重组猪源罗伊氏乳酸杆菌pPG-LFCA-E/LR-CO21作为饲用微生态制剂对仔猪促生长与抵抗猪霍乱沙门菌感染的作用。将该重组菌连续饲喂28日龄断乳仔猪21 d,并设立空菌组、对照组以及抗生素组。第21天时对断乳仔猪连续口服感染猪霍乱沙门菌3 d,并设置7 d的观察期;仔猪感染后采集试验组与对照组血清、肠黏液及肠组织。检测结果显示重组菌组仔猪平均日增重与免疫器官指数均显著提高（P<0.05）,料重比极显著降低（P<0.01）。感染猪霍乱沙门菌后,相对于对照组,重组菌组仔猪日增重提高,腹泻率降低;重组菌组仔猪血液中IgG以及肠黏液中IL-4、sIgA的量极显著提高（P<0.01）,IL-2、IL-12、IL-6的量显著降低（P<0.05）;重组菌组仔猪肠道紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1的基因转录水平和TLR4、Myd88和MLCK的基因转录水平极显著提高（P<0.01）,仔猪肠道内猪霍乱沙门菌的数量极显著降低（P<0.01）;重组菌组与抗生素组无明显差异（P>0.05）。以上结果表明,表达牛乳铁蛋白肽的重组猪源罗伊氏乳酸杆菌pPG-LFCA-E/LR-CO21可以提高断乳仔猪的生长性能、促进肠道形态发育、增强肠道屏障功能,并且在一定程度上可以保护仔猪免受猪霍乱沙门菌的感染,表明重组菌作为微生态制剂替代断乳仔猪的饲用抗生素具有一定的应用前景。     

双抗体夹心ELISA检测排泄物PEDV

用蔗糖密度梯度离心法纯化猪流行性腹泻病毒(PEDV)免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术获得2株分泌抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)单克隆抗体,建立检测PEDV的双抗体夹心ELISA方法。结果表明,该双抗体夹心ELISA最佳反应条件为,兔抗PEDV抗体稀释度为1:800包被37℃1 h加4℃12 h,样品反应时间为90 min,酶标抗体工作浓度为1:2 000作用45 min,以OD490nm≥0.37作为阳性判定标准。该ELISA的重复性变异系数小于10%,最低检测限为5×103.67TCID50/m L,并与猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒无交叉反应。用该ELISA方法和RT-PCR方法检测48份临床粪便样品,结果显示,ELISA阳性检出率为39.6%,而RT-PCR方法检测卡的阳性检出率为43.8%。表明双抗体夹心ELISA方法具有特异性强、灵敏性高和重复性好等优点,可用于PEDV快速检测。     

猪流行性腹泻病毒Nsp6蛋白的分段表达及多克隆抗体制备

猪流行性腹泻病毒(PEDV)的非结构蛋白Nsp6在诱导宿主细胞自噬中起着重要作用。为进一步确定Nsp6蛋白诱导细胞自噬的关键功能域,本研究利用RT-PCR扩增技术获得了Nsp6及其3个分段基因。首先构建了重组原核表达质粒pSUMO-Nsp6,并转化至大肠杆菌Rosetta感受态中,经IPTG诱导并纯化后,所得蛋白用于小鼠免疫,制备抗Nsp6蛋白的多克隆抗体。再将Nsp6及其3个分段基因分别构建至真核表达载体pCMV-HA,并将其转染至IPEC-J2细胞进行真核表达,通过Western blot和双荧光标记法来确定蛋白表达情况。结果：Nsp6蛋白在Rosetta中成功表达,并通过免疫小鼠获得了效价为1∶10 240的多克隆抗体,该抗体具有与PEDV和Nsp6蛋白特异性结合的能力;免疫荧光及Western blot结果表明,Nsp-6及其截短基因在IPEC-J2细胞中成功表达,且与制备的Nsp6多克隆抗体发生特异性结合。综上,本研究原核表达了Nsp6蛋白并制备了相应的特异性抗体,验证了Nsp6及其分段基因的在细胞中的真核表达,为进一步研究Nsp6蛋白的特性和功能奠定了基础。     

重组猪源罗伊氏乳酸杆菌分泌表达牛乳铁蛋白肽对新生仔猪生长性能的影响以及抗腹泻病毒感染的保护作用研究

本试验旨在研究分泌表达牛乳铁蛋白肽(LFCA)的重组猪源罗伊氏乳酸杆菌对新生仔猪生长性能的影响以及对引起仔猪腹泻的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)感染的保护作用.试验1:选取36头1日龄、体重约为1.5 kg的新生杜长大仔猪,随机分为3组,分别为重组菌组、空载菌组和对照组,每组12头仔猪,分别口服表达LFCA的重组猪源罗...