坛紫菜天然红色变异体的分离与特性分析

在坛紫菜栽培群体中发现一棵红色块与野生色块相嵌的颜色变异叶状体,在实验室进行红色藻块的体细胞再生克隆培养,获得了纯红色变异体。与野生型相比,红色变异体在叶状体的形态、颜色、生长速度、成熟、藻胆蛋白及叶绿素含量等方面均存在着明显的差异。红色变异体的颜色呈铁锈红色,体形宽大,生长速度明显快于野生型,培养400多天仍不成熟。与野生型相比,它的叶状体活体吸收光谱除各吸收峰的峰值有变化外,第4个吸收峰的峰顶(藻蓝蛋白的吸收峰)向短波方向移动了约3 nm,表明其藻红蛋白的结构有可能发生了改变。另外,它的藻红蛋白(PE)和叶绿素a的含量均显著增加,但藻蓝蛋白(PC)的含量有所下降,使得PE/Chl. a和PC/Chl. a的比值较高, 但PE/PC比值较低。培养400 d的红色变异体的体细胞再生体中,正常叶状体和畸形叶状体的百分数分别为78.49%和19.81%,根丝细胞苗占1.7%,未见细胞团出现,说明该变异体的不成熟是由叶状体的细胞分化严重延缓所致。     

条斑紫菜耐高温杂交重组品系的筛选与特性分析

为改善条斑紫菜优良品系TM-18藻体颜色偏红的弱点,本研究以红色型突变品系(TM-18,特点:藻体偏红色;生长快,色素蛋白含量高,具有一定的耐高温性)为父本;绿色型突变品系(OMO-1,特点:藻体绿色,生长较慢,色素蛋白含量低,耐高温性差)为母本进行种内杂交,从杂合丝状体的F1叶状体中,分离出了优良品系TW-9。通过比较它与亲本品系的特性,获得以下结果:在常温(18°C)和高温(24和25°C)下培养13 d,TW-9品系的壳孢子存活率分别为TM-18品系的1.0、1.1和1.1倍,以及OMO-1品系的1.1、4.7和7.2倍。在18°C组,3个品系的壳孢子苗畸形率无显著性差异,但在24和25°C组,TW-9品系的畸形苗率比TM-18品系分别降低了20.3%和29.5%,比OMO-1品系分别降低了74.8%和69.5%。将在18°C下培养40 d的叶状体分别置于18、24和25°C再培养10 d,TW-9品系的绝对生长率分别为TM-18品系的0.9、1.5和0.8倍,以及OMO-1品系的1.4、1.5和28倍。此外,在24°C下培养25 d或在25°C下培养10 d,OMO-1品系的藻体腐烂严重,最后完全解体;TM-18和TW-9品系藻体在24°C下培养25 d只出现轻微卷曲,但在25°C下,TM-18品系培养15 d就腐烂至完全解体,而TW-9品系培养30 d也只是轻微腐烂。在18°C下培养40 d的TW-9品系叶状体分别再在18和24°C下培养15 d,总藻胆蛋白含量分别为61.5和77.8 mg/g,分别为OMO-1品系的1.4和1.4倍,但与TM-18品系的含量相比无明显差异。在18°C下培养55 d的叶状体平均厚度,TW-9品系为25.6μm,分别比TM-18和OMO-1品系降低了13.5%和17.7%。另外,3个品系的壳孢子放散量无显著性差异。研究表明,TW-9品系不仅具有与TM-18品系相似的特性,如叶状体生长快、色素蛋白含量高、壳孢子放散量大等特性,并且它的藻体更薄、更耐高温,其颜色与野生色相近,符合生产栽培的要求,有望被培育成适宜栽培的新品种。     

坛紫菜有丝分裂阻滞缺陷蛋白2基因(Ph-mad2)的克隆及其在单性生殖过程中的表达

为探究坛紫菜雌配子体单性生殖过程的细胞二倍化机制,实验基于坛紫菜雌性配子体的转录组信息,克隆和分析了坛紫菜的有丝分裂阻滞缺陷蛋白2(PhMAD2)基因(Phmad2),同时对其在坛紫菜单性生殖发生过程中处于不同发育时期的细胞中的表达特征进行了初步研究。结果显示,坛紫菜Ph-mad2基因的cDNA的完整开放阅读框为672 bp,编码223个氨基酸,分子量为23.8 ku。从氨基酸序列比对结果可知,坛紫菜PhMAD2蛋白中所具有的典型的HORMA结构域和保守的丝氨酸和苏氨酸磷酸化位点,均与团藻和莱茵衣藻MAD2蛋白相同。系统发育分析表明,坛紫菜与藻状菌纲的异丝水霉和寄生水霉的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR检测显示,与可进行正常有丝分裂的营养细胞相比,在坛紫菜单性生殖过程中发生细胞二倍化的生殖细胞和单性孢子时期,Ph-mad2基因的表达量显著下降;但是,在随后可进行正常有丝分裂的单性孢子萌发体细胞和处于营养生长期的单性孢子体细胞中则表达上调。这一结果暗示Ph-mad2基因的表达下调可能阻碍了坛紫菜单性生殖初期单倍体细胞进行有丝分裂时纺锤体组装检验点的形成,在一定程度上致使它们发生了染色体加倍。     

上海低盐海区的坛紫菜栽培试验

为建立低盐度海区的紫菜栽培模式,选用人工选育的耐低盐坛紫菜品系(DY-1),于2010—2013年在芦潮港海区开展了生产性栽培试验.2010—2011年度试验栽培面积为0.2 hm2,获得了初步成功;2011—2012和2012—2013两个年度试验栽培面积均为1 hm2,生产期分别为181 d和174 d,均采收了4...     

盐度对条斑紫菜体细胞生长发育的影响及耐低盐度变异体的初步观察

盐度对条斑紫菜体细胞的生长发育有明显的影响．盐度在19．0—32．8‰之间，体细胞生长发育正常；但超过32．8或低于19．6‰，体细胞成活率均下降，发育速度明显减慢．适当剂量的紫外线能促进体细胞苗生长，且可提高体细胞后代对高盐度和低盐度的忍耐力，同时获得少量能在低盐度下生长的变异体．刚酶解出的体细胞在高盐度下培养1天，然后逐渐降低盐度，可获得较高的成活率．     

坛紫菜体细胞的连续克隆培养和悬滴培养

随着用于分离海藻体细胞和原生质体工具酶的增多,近几年来,海藻单离细胞和原生质体的培养取得了较大进展,特别是对一些经济海藻如海带、紫菜的原生质体培养,国内外均进行了大量研究。严兴洪等把坛紫菜叶状体体细胞的复杂发育分化趋势初步归结成八类,并且建立了坛紫菜叶状体体细胞的分化模型。阐明坛紫菜叶状体体细胞的发育分化规律,不仅能为利用坛紫菜体细胞直接快速采苗,改进传统采苗工艺的新技术提供科学的理论依据,而且对于开展坛紫菜体细胞与其它紫菜间的细胞融合的正确选材以及细胞融合以后的杂种筛选等研究均具较大意义。为此,我们对坛紫菜叶状体体细胞进行了连续数代克隆培养。单个细胞培养在高等植物中已获成功,但在海藻细胞培养中还未见报道,探讨单个细胞培养途径,对开展海藻细胞工程研究具重要价值。结果报告如下:     

抗生素处理对坛紫菜叶状体生长和藻际微生物的影响

设计了氨苄青霉素、硫酸庆大霉素和卡那霉素3种抗生素的不同组合处理坛紫菜叶状体,旨在筛选出坛紫菜叶状体藻际微生物的最优去除方法;同时,探究紫菜叶状体生长与微生物群落变化之间的关系。结果显示,低浓度(10μg/mL)的硫酸庆大霉素或高浓度(800μg/mL)的卡那霉素处理,对坛紫菜叶状体生长均具一定的抑制作用,而不同浓度的氨苄青霉素处理均促进了叶状体生长。500μg/mL的氨苄青霉素、500μg/mL的硫酸庆大霉素与300μg/mL的卡那霉素3种抗生素混合处理叶状体24 h,不会抑制叶状体的生长;同时,对藻际微生物有较强的抑制性。不同的坛紫菜品系,不同的叶状体日龄和培养密度,以及在不同的海水盐度和不同浓度的营养盐中培养,抗生素处理组圆盘体的生长均比对照组快。通过比较抗生素处理组与对照组分离的菌株后发现,抗生素处理组有两株菌落形态和菌株形态与对照组显著不同的特有菌株。研究表明,在坛紫菜叶状体的生长过程中,某些对叶状体生长起阻碍作用的细菌如果大量繁殖,会抑制对叶状体生长有益的细菌繁殖,当用抗生素抑制了阻碍生长的细菌,就会使益生菌成为优势菌,促进叶状体的生长,益生菌对上述抗生素的处理不太敏感,但由于培养条件的改变,抗生素对阻碍生长的细菌的抑制作用会减弱,使得它们大量繁殖,从而抑制叶状体的生长。     

坛紫菜优良品系“申福2号”的特性分析与海区中试

以人工选育的坛紫菜优良品种“申福1号”( SF-1)、优良品系“申福2号”(SF-2)和野生型品系(WT)为材料,通过室内培养与海区中试,对SF-2的优良特性和生产适用性进行评估.结果发现,与WT相比,SF-2的叶状体在生长速率、藻胆蛋白含量、藻体厚度及产量上均存在十分显著的优势.在相同的室内培养条件下,SF-2叶状体的绝对生长速率显著高于WT,培养至90d时,其平均长度为(391.6 ±47.37) cm,是WT的10倍.3个品系(种)的叶状体活体吸收光谱在350～750 nm范围内均存在5个明显的吸收峰,SF-1与SF-2之间的各峰值差别较小,但均明显高于WT.SF-2叶状体的藻胆蛋白(PE+PC)含量为(90.81±3.98) mg/g,是WT的1.95倍左右,比SF-1的含量稍高.SF-2叶状体的平均厚度为(31.95±4.16) μm,分别比WT与SF-1薄38.7％和14.0％.SF-2的壳孢子放散量约为28.6万个/壳,比SF-1提高了43.0％,可以满足生产采苗需求.海区栽培的前四水鲜菜重量,SF-2为24 000 kg/hm2,比WT和SF-1分别增加30.1％和6.7％.上述结果证实,SF-2的海区壳孢子放散量可以达到生产要求,叶状体的生长速率、生长期、产量和品质比WT均明显提高,生长优势十分明显.所以,该品系有望在生产上进行大规模栽培.     

坛紫菜减数分裂位置的杂交试验分析

利用坛紫菜人工色素突变体与野生型进行杂交试验,通过观察F1叶状体中是否出现颜色分离和颜色嵌合体来证明坛紫菜减数分裂发生的确切位置。以红色型人工色素突变体(SPY1和R10)作为母本,其特征:叶状体呈红色或桔红色,藻体薄而弹性差,无边缘刺;以野生型(wt)作为父本,其特征:叶状体呈棕绿色,藻体厚而富有弹性,有丰富的边缘刺。在杂交组SPY1(♀)×wt(♂)和R10(♀)×wt(♂))的F1叶状体中,均出现了2种亲本色和2种新颜色,它们分别为红色(R,母本色),野生色(W,父本色),浅红色(R′,比R色稍浅)和似野生色(W′,比野生色稍红)。4种颜色在F1叶状体上,出现了分离并形成了呈直线型排列的不同色块,从而产生了大量由2～4个色块组成的颜色嵌合体;单个嵌合体上的色块数最多为4块。在颜色嵌合体中,R和R′2种色块的藻体薄而弹性差,无边缘小刺,而W和W′2种色块的藻体厚而弹性好,富有边缘刺。在F1叶状体中,颜色嵌合体占95.2%～96.7%,单色叶状体只占3.3%～4.8%。上述结果说明,坛紫菜杂合丝状体产生的壳孢子,其萌发时进行的最初两次细胞分裂是减数分裂,它所产生的4个子细胞继续分裂,最终发育成含2～4个色块组成的颜色嵌合体;2种新颜色是由于在减数分裂的第一次分裂时发生了染色体交换和重组所产生的。本文使用的两个色素突变体,除含2个或2个以上的颜色变异基因外,还含有分别与藻体厚薄和边缘刺出现相关的变异基因,并且它们与颜色变异基因是连锁的。F1颜色嵌合体中的重组色块在3种主要光合色素和色素蛋白的含量、生长速度和成熟早晚等方面均表现出比亲本色块更好的特性,暗示利用色素突变体杂交方法有可能培育出坛紫菜的优良品系。     

坛紫菜与长紫菜种间杂交后代的细胞崩溃现象与成活后代的表现型观察比较

坛紫菜壳孢子萌发的第一次和第二次分裂为减数分裂,结束后形成了一个基因型不同的四分体,随后由这个四分体发育成一个基因型嵌合的叶状体。由坛紫菜与长紫菜种间杂交所产生的杂合丝状体成熟后释放出壳孢子,后者在分裂初期出现了大量的细胞崩溃死亡,通过对单个的壳孢子萌发体进行定点跟踪观察后发现,细胞崩溃死亡不仅会发生在减数分裂的直接产物即处于二细胞期、三细胞期、四细胞期的萌发体,当细胞数大于4个的萌发体在进行有丝分裂时也会出现细胞崩溃死亡。绝大部分的壳孢子能进行第一次减数分裂,形成处于二细胞期的萌发体,随后进行第二次减数分裂,形成处于三细胞期或四细胞期的萌发体。培养4 d,78.6%的壳孢子已发育成含2~4个细胞的萌发体,其余为未分裂的壳孢子萌发体;在含2~4个细胞的萌发体中未出现细胞崩溃死亡的萌发体的百分率为99.7%,0.3%的个体出现了细胞崩溃死亡。随着培养时间的延长,大多数处于二细胞期的萌发体发育成处于三细胞期和四细胞期的萌发体,而大规模的细胞崩溃死亡也出现在处于三细胞期和四细胞期的萌发体中。培养14 d,处于三细胞期和四细胞期的萌发体的百分率分别为38.6%和37.2%,它们当中含有崩溃死亡细胞的个体百分率分别为99.5%和99.2%。此外,8.9%的萌发体能够发育成含4个以上细胞的个体,但在随后的有丝分裂中也出现了细胞崩溃死亡现象。培养35 d,大部分的萌发体其体细胞已全部崩溃死亡,但仍有约1%的萌发体能成活下来,可它们并非是由一个完整的四分体发育而来,而是由四分体中的1~2个成活细胞发育而来。培养45 d,可把成活体的形态和颜色分成类亲本型和重组型两大类。研究表明,利用紫菜种间杂交的后代在壳孢子萌发初期会出现细胞崩溃死亡的现象,不仅可以用于辅助更精确地鉴别物种,而且可以从其成活后代中筛选出具有重组优势的新品系。