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为建立检测水貂犬瘟热病毒(mink canine distemper virus, CDV)的微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)定量方法,以便提供水貂CDV在诊断检测方面的技术支持,本研究根据实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)检测方法原理,建立了水貂CDV数字PCR方法,并优化了反应条件,评估了特异性、敏感性以及重复性。结果表明:ddPCR方法检测CDV的最适引物浓度为900 nmol/L,探针浓度为250 nmol/L,退火温度为55℃,升降温度为2.5℃/s,最低检测下限为4.4拷贝/μL;除CDV特异性扩增,其他常见病毒特异性检测结果均为阴性;重复性试验的变异系数均小于5%。采用该微滴数字PCR和荧光定量RT-PCR方法对30份犬、貂、狐、貉等组织(其中CDV阳性样品7份)样品进行检测,检测结果与临床检测结果相符。本研究建立的微滴数字PCR方法对CDV定量检测特异性强、灵敏度高,重复性好,可以用于水貂CDV临床样品的核酸检测,对水貂CDV发病早期的诊断提供新的定量检测方法。 相似文献
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为实现利用生物反应器制备规模化、自动化生产水貂犬瘟热Vero活疫苗,在7 L生物反应器中悬浮培养Vero细胞,并考察培养基、细胞初始接种密度、培养方式、病毒感染复数和感染时间等参数对细胞增殖、病毒滴度以及细胞代谢的影响。结果显示,在含有5 g/L微载体的DMEM培养基中接种Vero细胞(30~40 cells/球),设定p H、温度、溶氧值和转速分别为7.2、37℃、50%和55 r/min,培养方式为批次培养(0~48 h)+灌流培养(48~96 h)组合方式,培养Vero细胞3~4 d或细胞密度达到200 cells/球以上时,按照MOI=0.0001~0.001吸附接毒,调低温度(33℃)继续培养100~120 h,即可获得高滴度病毒液(10~(6.5)~10~(7.2)TCID_(50)/0.1 m L),经无菌检验合格后,配制水貂犬瘟热Vero细胞活疫苗(CDV3-CL株,悬浮培养),疫苗符合《中国兽药典》三部(2015版)的规定。试验建立了7 L生物反应器悬浮培养Vero细胞制备水貂犬瘟热活疫苗的新工艺,为进一步规模化生产奠定了基础。 相似文献
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依据GenBank中登录的坏死梭杆菌外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)基因序列,设计1对引物进行PCR扩增OMP片段并克隆至pET-28a中,构建原核表达重组质粒pET-28a-OMP。将pET-28a-OMP转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态中,表达含2个His的重组蛋白。SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,该重组蛋白分子质量为93 ku,为包涵体表达,具有反应原性。本试验结果为坏死梭杆菌OMP免疫机制的研究提供了基础数据。 相似文献
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为了解我国河北省貉细小病毒(RDPV)生物学特性,通过细胞培养从河北省某貉养殖场发病貉组织样品中分离到1株病毒,经病料样品的PCR鉴定、病毒分离培养及形态学观察、猪红细胞凝集试验、基于VP2基因建立的系统发生树分析、同源性分析、动物回归试验等方法对分离株进行鉴定。结果显示,用特异性引物对病料样品进行PCR鉴定,可扩增得到573 bp特异性条带;分离病毒可在F81细胞中进行培养并产生明显的CPE;电镜下可见25 nm左右细小病毒样病毒粒子;猪红细胞凝集试验(HA)结果显示,分离株对猪红细胞血凝效价可达到1∶1 024;VP2基因序列比对及进化分析结果显示,RDPV-HeB16与RPDV-LN10-1处于同一进化分支;同源性分析结果显示,与参考序列VP2基因相似性在98.4%~99.5%之间;将病毒培养物感染健康貉,结果显示感染组的貉均出现典型RDPV临床症状,正常对照组未发病。综上所述,本研究结果表明从发病貉病料样品中分离到1株RDPV,命名为RPDV-HeB17。本研究所获数据将对我国RDPV的流行及该病毒的遗传进化分析、疫苗和诊断制品的研究提供参考。 相似文献
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为确定河北昌黎地区某养殖场貉呼吸道疾病引起死亡的病因,本研究从送检的貉病料肺脏中分离到1株革兰氏阴性短杆菌,并对分离株进行形态学观察、16S rRNA序列测序及全自动细菌生化鉴定仪鉴定,在此基础上完成了分离株的分型、人工感染小鼠试验及药敏试验等。结果显示,该分离株为非K1/K2型肺炎克雷伯菌,并将其命名为CLKp18;该分离株的16S rRNA基因序列与GenBank中登录的多株肺炎克雷伯菌参考株同源性均高达99%。Vitek全自动细菌鉴定仪结果表明,该菌株与肺炎克雷伯菌鉴定标准相似度为99%。人工感染小鼠试验结果显示,试验组小鼠在攻毒后6 h开始出现临床症状。无菌取出死亡小鼠的肺脏、肝脏、脾脏及肾脏,划线涂板,均可分离到该菌,表明该分离株感染小鼠后,能侵入到小鼠体内多个组织器官,引起不同程度的病变,尤以肝脏和肺脏病变较为明显,对小鼠的半数致死量(LD_(50))为2.17×10~7 CFU。药敏试验结果表明,该菌对单环内酰胺类、氯霉素类、氨基糖苷类、四环素类、磺胺类及大部分头孢类耐药,但对阿米卡星、阿莫西林/克拉维酸、头孢他啶和亚胺培南敏感。本研究结果确定了引起本次貉呼吸道症状疾病的致病菌为非K1/K2型肺炎克雷伯菌,且该分离株有较强的致病性和多重耐药性。本研究为临床治疗由该菌引起的貉肺炎提供了参考依据。 相似文献
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<正>为了保证毛皮动物饲养业的发展,广大饲养者应该遵照"预防为主、防重于治"的原则,对恶性传染病必须重点预防;对一般性疾病应加强饲料、饮水卫生管理,对兽群加强饲养,提高机体抗病力。 相似文献
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坏死梭杆菌研究进展 总被引:1,自引:0,他引:1
坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum,Fn)是一种严格厌氧的革兰阴性多形态杆菌,其致病因子包括内毒素、白细胞毒素、血小板凝集因子、血凝素和溶血素等,其中主要的致病因子是白细胞毒素。由坏死梭杆菌引起的疾病在不同国家和地区均有发生,鹿、羊等反刍动物感染坏死梭杆菌时表现为跛行,关节肿大,肝脓肿和腐蹄病,猪、马等动物感染坏死梭杆菌时主要表现为跛行,严重时继发其他细菌感染,对养殖业造成巨大损失;人类感染该细菌时表现为急性咽炎综合征(Lemierres syndrome)。论文通过对国内外坏死梭杆菌及其疫苗研究和新型佐剂的开发进行综述,以期为该细菌疫苗的研制提供参考。 相似文献