转移因子与重组转移因子及其在疾病防治中的应用

转移因子是来自于免疫淋巴细胞的一类可透析小分子多肽,它能够将致敏淋巴细胞的免疫信息传递给未致敏的受体淋巴细胞。转移因子具有特异性和非特异性免疫活性,特异性转移因子具有转移特异性细胞免疫的能力,非特异性转移因子具有促进淋巴细胞活化增殖,增强其免疫活性,并可诱导靶细胞产生大量的细胞因子。重组转移因子是利用基因工程技术将编码具有免疫增强活性的转移因子基因,进行克隆和体外表达,表达产物经纯化制备而成,试验表明其具有增强细胞免疫活性的作用。转移因子和重组转移因子是一种具有免疫增强活性的新型高效安全的生物药品,在临床上用于疾病的防治,具有广阔的应用前景。     

鸭绿江茴鱼人工繁殖技术的研究

鸭绿江茴鱼目前已经濒临绝迹,为保护这一濒危物种,并扩大其种群数量,根据该鱼的生物学特性,对鸭绿江茴鱼亲鱼的驯化方法,性成熟年龄,繁殖季节,人工授精方法,孵化方法,鱼苗培育,饵料投喂等进行了研究。结果表明:鸭绿江茴鱼性成熟年龄为2龄;产卵期在4月中旬至5月末;卵在水温8℃经17 d左右,累积温度达135度日开始发眼;25 d左右,累积温度达200度日开始破膜;32 d左右,累积温度达250度日开始上浮;经36 d左右,累积温度达290度日开始驯化摄食;开口摄食时投喂适合鱼苗吞咽的活饵料(小型枝角类、桡足类);1个月后体长达2.5 cm时,投喂大型枝角类、桡足类和适合摄食的鸡蛋羹。研究结果显示,鸭绿江茴鱼可以通过人工手段进行繁殖。     

大熊猫犬冠状病毒部分S基因的克隆与全S基因序列分析

从重庆某动物园死亡的大熊猫肝脏中分离到一株病毒，经鉴定为犬冠状病毒（命名为CCV DXMV）。本实验根据CCV K378和CCV Insavc-1株基因序列设计合成了普通PCR引物SF1-SR1和SF2-SR2，以及半套式引物SF3-SR3、SR13、SF13、SF4-SR4和SF14，分段扩增了CCVDXMV株部分S基因，得到了368bp、792bp、737bp、1178bp和985bp5个基因片段。将纯化的RCR产物分别克隆到pGEM—T载体中，通过筛选和鉴定，获得了5个阳性重组质粒。将重组质粒送生物公司测序，将测得的基因序列与先前测定的该株病毒部分S基因序列，拼接成全S基因序列，并与其它株CCV及TGEV HN2002和FIPV79—1146株的S基因序列进行分析比较，绘制进化树。结果表明，该株病毒与CCV K378株的同源性最高，达到99．4％；而与CCV 23／03株的同源性最低，为56．9％；与FIPV和TGEV分别有90．4％和82．1％的同源性。     

小熊猫源犬瘟热病毒全基因序列的克隆及序列分析

本研究对军事兽医研究所病毒二室分离驯化后的小熊猫源犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)基因组进行全序列测定,并对其基因组特征及H基因遗传稳定性进行比较分析。根据GenBank公布的犬瘟热病毒全长基因组序列设计合成17对特异性引物,以小熊猫源犬瘟热病毒总RNA为模板,RT-PCR进行分段扩增,并克隆到pEASY-Blunt Simple载体中,经测序、拼接获得全长cDNA序列。结果显示,小熊猫源犬瘟热病毒全基因序列与GenBank登录号分别为AF014953、AY445077、AY542312、AY466011、AY386316、AF164967、EU716337、EU726268、AY443350、AB474397、GU138403和AY649446的12个不同毒株全基因序列的同源性分别为86.6%、92.4%、92.5%、92.5%、94.3%、96.3%、95.9%、87.1%、94.5%、92.3%、87.4%和94.6%,与标准强毒株A75/17株(AF164967)的亲缘关系最近,全基因同源性达96.3%,但与疫苗株Onderstepoort(AF014953)亲缘关系相对较远,同源性为86.6%。小熊猫源犬瘟热病毒H基因与其他不同地区具有代表性的30株CDV进化树分析显示,小熊猫源犬瘟热病毒属于Asia Ⅰ型,H蛋白中309－311位氨基酸残基所形成的潜在糖基化位点,为疫苗株没有而野毒株所共有的,并且可能与病毒的免疫原性有关。因此,致弱的小熊猫源CDV在预防免疫的针对性上可能强于已有的疫苗株。     

犬冠状病毒基因疫苗表达载体的构建及其免疫原性研究

以pVAX1为载体首次构建了犬冠状病毒病基因的3种真核表达质粒。首先将犬冠状病毒大熊猫株（CCVDXMV）纤突蛋白（S）、膜蛋白（M）和核蛋白（N）基因进行了克隆和序列测定。将测序后的质粒pTS、pTM和pTN分别双酶切，回收目的基因片段并将其定向克隆到真核表达质粒pVAX1中得到重组质粒pVAXS、pVAXM和pVAXN。将这3种真核表达质粒通过脂质体介导法转染MDCK细胞，通过RT—PCR法进行转录水平的检测，并用间接ELISA法检测目的蛋白的表达情况。结果在pVAXS、pVAXM、pVAXN转染MDCK细胞36h后就可检测到目的基因的转录；在转染72h后可检测到3种目的蛋白的表达。动物免疫试验表明，3种真核表达载体能有效地诱导机体产生细胞免疫与体液免疫应答，这为CCV基因疫苗的研究奠定了良好的基础。     

三株鸡传染性法氏囊病毒弱毒株的分离与分子鉴定

本试验在江苏省鸡场分离获得3株鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）,采用RT—PCR法扩增VP2基因,将产物克隆入pMD18T载体,经测序,并与IBDV代表株VP2基因的高变区序列进行分析比较。结果显示,3个分离株与超强毒株、强毒株、突变株及弱毒株的核苷酸同源性在89．5％～98．9％之间,与弱毒株Cu-1和疫苗株PBG-98同源性最高,为98．9％;推导出的氨基酸序列与代表性毒株的同源性在98．2％～99．5％之间。其中,七肽区的第三个丝氨酸残基突变为精氨酸或苏氨酸,279和284位氨基酸残基突变为天冬氨酸和苏氨酸,222、294和299位氨基酸残基分别突变为脯氨酸、亮氨酸和天冬氨酸。上述试验表明3株分离株均为临床弱毒株。     

成年兔睾丸支持细胞的分离纯化研究

本试验以5月龄公兔为试验动物,去除睾丸被膜及血管,分离出完整的曲精细管后 用0．5％胰蛋白酶和0．1％胶原酶消化并进行低渗处理,将制成的细胞悬液植入25 cm2的培 养瓶,于38．7℃、5％CO2条件下培养,结果表明:经1:3Hanks超纯水低渗处理后,离体支持 细胞纯度和活率分别达到72．04％和84．5％,显著提高了离体支持细胞的获取量和活率。     

应用竞争PCR检测丙酸盐对体外培养牛肝细胞丙酮酸羧化酶mRNA水平的影响

根据牛肝细胞内PC(丙酮酸羧化酶)基因组与PCcDNA相比多含有一个内含子序列．在其中再插入一外源DNA序列．从而使最终构建的突变体片段的长度大于PCcDNA的长度，成功构建了PCcDNA的竞争DNA模板，然后应用竞争PCR方法研究了丙酸盐对体外培养新生牛单层肝细胞PCmRNA水平的影响。使单层肝细胞培养液中丙酸钠浓度分别为0、1．5、2．5、3．5、4．5、8．5、11．5mmol／L，处理24h，提取总RNA、逆转录，在同一体系中用相同引物扩增目的带和竞争模板带。结果表明．随着丙酸钠浓度的升高．PCmRNA水平呈上升趋势，提示肝细胞内PCmRNA的表达水平受培养液中丙酸钠浓度的影响。     

安氏隐孢子虫ITS-1序列的PCR扩增、克隆及分析

通过对国内三株安氏隐孢子虫(Cryptosporidium andersoni)即GD株、HN株和AH株的rDNA的内转录间隔区Ⅰ(ITS_1)序列进行PCR扩增、克隆、测序和序列分析,旨在确定ITS_1是否可作为C.andersoni分子分类的遗传标记。结果表明:GD株、HN株和AH株的ITS_1序列基本一致,仅AH株有三个碱基的差异;但与GenBank注册的C.muris和C.parvum存在种间差异,而且差异显著。说明ITS_1可作为C.andersoni种的遗传标记,从而为隐孢子虫属的种间鉴定以及进一步的分子流行病学调查和分子诊断学研究奠定了基础。     

贵州地方猪品种HSL基因多态性与屠宰性状的关联性研究

本研究旨在分析HSL基因多态性与地方猪品种瘦肉率之间的相关性。采用RFLP方法,以二元杂交猪（长白猪×大约克猪）为对照,对贵州地方猪品种糯谷猪和萝卜猪的HSL基因进行多态性分析。结果表明,贵州地方猪品种HSL基因外显子1中存在BsaH I酶切片段长度多态性,从3个猪群体中都检测到AA、AB和BB基因型,克隆测序后证实,A等位基因于第442 bp处发生了单碱基突变（G→A）,导致氨基酸Val→Ile替换。地方猪品种以A等位基因占优势,杂交猪以B等位基因占优势。将猪胴体性状与HSL基因型之间进行关联分析,结果显示大部分年龄段的猪品种中,BB、AB和AA 3种基因型的瘦肉率和眼肌面积均表现出从高到低的变化趋势,而背膘厚则完全相反。结果提示,HSL外显子1的B等位基因具有增加胴体瘦肉率和眼肌面积、降低背膘厚的遗传效应,可作为贵州地方猪品种瘦肉率的分子标记。