牛副结核分枝杆菌LAMP快速检测方法的建立

为建立牛副结核分枝杆菌(MAP)的快速检测方法,本研究采用环介导等温扩增(LAMP)技术,以MAP的IS900基因序列为靶基因设计特异性引物,建立了MAP特异性的LAMP快速检测方法。经反应条件优化,检测结果显示,建立的LAMP检测方法具有良好的特异性,最低见测量为0.53 pg;与其他病原菌无任何交叉反应。临床样品检测与行业标准的符合率为100%。该LAMP检测方法可以用于MAP的常规检疫。     

应用RT-PCR和病毒学方法诊断山东省鸡新城疫感染的比较研究

分别应用病毒分离和区分新城疫强弱毒株的RT—PCR技术,对山东各地疑似鸡新城疫感染的25份病料进行了实验室诊断。结果表明：从18份病料中既扩增到了新城疫强毒基因,也分离到了新城疫病毒;3份病料未分离到病毒,仅扩增到了新城疫强毒基因;4份病料分离到了新城疫病毒,但未检测到相关基因。研究表明,将RT—PCR和病毒分离鉴定两种方法相结合,可更好的满足快速、灵敏、准确的新城疫诊断要求。     

牛分枝杆菌特异性PCR检测方法的建立及初步应用

根据已发表的牛分枝杆菌的pncA的基因序列，设计和合成了一对可扩增294bp目的片段的引物，建立了特异性检测牛分枝杆菌的PCR方法。对牛分枝杆菌国际参考株和国内分离株成功扩增出294bp的特异性基因片段；对人结核分枝杆菌、副结核分枝杆菌、鸟胞内分枝杆菌和草分枝杆菌DNA的PCR扩增结果均为阴性。本PCR方法检测的敏感度可达到50pg。对10份牛分枝杆菌培养阳性和10份阴性样品的DNA分别进行了PCR检测，结果10份阳性样品中有9份样品为PCR扩增阳性，阳性符合率为90％（9／10）；而10份阴性样品则PCR扩增全部为阴性，阴性符合率为100％（10／10）。本方法可做为牛分枝杆菌的快速检测和流行病学调查的工具。     

猪戊型肝炎病毒分子生物学与流行病学研究进展

戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)是20世纪80年代发现的又一新型肝炎病毒,近年来对戊型肝炎病毒病原学、流行病学、实验室诊断、基因结构等方面研究取得了重大进展,本文就HEV的形态、基因分型、分子生物学特性、戊型肝炎(Hepatitis E,HE)的流行病学特点作一简要概述。     

广西猪瘟流行毒株全基因组的克隆与序列分析

参考已发表的猪瘟病毒(CSFV)Shimen株、HCLV株、Paderborn株的核苷酸序列，设计并合成11对引物。应用RT—PcR技术，成功地分11个片段扩增了CSFV广西流行毒株GXWZ02的全基因组，将这11个基因片段克隆，并测定了其核苷酸序列。应用计算机生物软件Vector NT1将11个基因片段进行拼接。确认CSFV GXWZ02株全基因组序列的长度为12296个核苷酸(GenBank收录号AY367767)。将GXXZ02株与国内外已发表的Slhimen、HCLV、39、Brescia、Eystrup、Glentorf、Alfort187、Pader190rn、CS、ALD、GPE、P97、LPC毒株进行全基因组核苷酸序列和推定的氨基酸序列比较，核苷酸同源性分别为85．4％、84．6％、88．7％、85．7％、85．7％、85．3％、85．6％、95．3％、85．7％、85．7％85．4％、83．4％、84．3％，推定的氨基酸同源性分别为92．6％、91．7％、94．2％、93．1％、92．9％、92．3％、93．0％、97．7％、92．6％、93．0％、92．6％、90．5％、90．6％。GXWZ02与Shimen、HCLV的全基因组序列及推定的氨基酸序列有明显差异，表明GXWZ02株在遗传性和抗原性上发生了较明显的变化。系统发育树分析，所比较的14株CSFV被分为2个群：GXWZ02、Paderborn和39这3个毒株被归为群Ⅰ，其余的11个毒株被归为群Ⅱ，GXWZ02与Paderborn的亲缘关系最接近。将GXXZ02与Shimen、HCLV基因组中单个基因分别进行核苷酸及推定的氨基酸序列同源性比较，结果显示，基因E^ms、E2、P7、NS2、NS5A的遗传变异程度大。而NS3、NS4A、NS4B的遗传性则相对保守。     

3株新城疫病毒广西分离株L基因的克隆与序列分析

根据GenBank登陆的新城疫病毒L基因序列,设计了3对引物(L1和L2、L3和L4、L5和L6)。用RT-PCR技术对3株新城疫病毒广西分离GX7/02、GX9/03、GX11/03的L基因进行了分段扩增和克隆,并对克隆出来的3个片段进行序列测定,用DNAstar软件比较分析后进行拼接,得到长约为6.8 kb、包含有L基因全长的核苷酸序列。L基因的RNA全长为6 704 bp,拥有一个6 615 bp的开放阅读框,推导其编码的氨基酸数为2 204个。氨基酸同源性分析表明广西分离株之间同源性为98.6%~98.7%;与ZJ1株同源性为98.8%~98.9%;与La-Sota、B1、F48E9、HB92同源性为92.0%~94.2%。     

鸡Mx基因的克隆与原核表达

本研究旨在通过克隆鸡Mx全基因序列进而进行该基因的原核表达,获得具有生物学活性的蛋白.利用poly Ⅰ:C诱导鸡胚成纤维细胞Mx基因表达,克隆了Mx基因全长cDNA序列,将开放阅读框(ORF)连接构建于表达质粒pGEX-4t-2中获得重组表达载体pGEX-Mx,转化Rosetta(DE3)菌株,经IPTG诱导后检测.表达产物检测显示该蛋白的相对分子量为75 ku.说明获得了Mx基因的高效表达,为进一步进行Mx基因的活性检测以及利用Mx蛋白进行抗病毒转基因的研究奠定了基础.     

小反刍兽疫病毒H糖蛋白基因原核表达载体的构建及表达

参照GenBank中小反刍兽疫病毒（PPRV）H抗原基因序列，人工合成了PPRVH基因，将其克隆至PUC18-T质粒中，转化E．coli JM109感受态细胞，构建并选择PPRVH基因克隆重组质粒，经核苷酸序列分析正确，将其克隆至pBAD／Thio—TOPO载体中，转化E．coli TOP10感受态细胞，核苷酸序列分析证实，成功构建了PPRVH基因重组表达载体。经不同浓度L-阿拉伯糖诱导，可稳定、高效地表达PPRVH抗原。SDS-PAGE分析结果表明，用终浓度为0．2g／L的L-阿拉伯糖诱导5h的表达量最高，表达蛋白为分子质量约83ku的融合蛋白；经薄层扫描分析，其表达产量约占菌体总蛋白的10％。Western-blotting检测表明，诱导的蛋白能与PPRVH蛋白单抗发生特异性反应，说明表达的融合蛋白中含有PPRVH糖蛋白抗原。     

NRTUAs感染对小鼠的组织荷虫量及脾脏细胞因子转录水平的影响

为进一步研究非增殖型尿嘧啶营养缺陷型弓形虫（NRTUAs）对小鼠的致病性,本研究以NRTUAs和Δku80虫株分别感染小鼠,每日检测各组小鼠的组织荷虫量,并检测感染后1～3d脾脏相关细胞因子的转录水平。结果表明：1)NRTUAs感染的小鼠不能在7d内清除虫体,NRTUAs刺激小鼠脾脏上调IL-12、TNF-α和IL-10的表达,并诱导温和的炎症反应;2）Δku80虫株感染的小鼠在感染后6d内死亡,组织荷虫量平均水平高于NRTUAs感染的小鼠,Δku80虫株刺激小鼠脾脏上调IL-12、TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ和IL-10的表达,诱导剧烈的炎症反应而导致小鼠死亡。综上,NRTUAs对小鼠的致病性较低,NRTUAs组织荷虫量平均水平低于Δku80组,诱导机体的炎症反应显著轻于Δku80组,为NRTUAs作为畜禽免疫增强剂的开发提供研究基础。     

鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因在杆状病毒表达系统中的表达

将鸡传染性贫血病毒M9905株VP1、VP2基因分别或同时克隆到杆状病毒转移载体pFastBacDUAL中，然后转化到DHIOBAC感受态细胞中与Bacmid杆状病毒穿梭载体进行转座重组，最后将重组子转染Sf9昆虫细胞，得到分别或同时含VP1、VP2基因的重组杆状病毒rBacVP1、rBacVP2及rBacVP1—2。PCR扩增结果证实VP1、VP2基因重组到杆状病毒基因组中；SDS-PAGE电泳分析和间接免疫荧光试验结果表明VP1、VP2基因在重组病毒中得到了表达。